吴林秀 何华梅 赵应学 黄文洁 周维海 梁红 黄敏琪 甄汉深 刘喜华

(1广西卫生职业技术学院，广西 南宁 530023；2广西壮族自治区江滨医院；3广西科康科技集团有限公司；4广西中医药大学)

近年来随着饮食结构变化，高尿酸血症的患病率不断攀升，我国社区老年高尿酸血症总患病率已达13.1%〔1〕。高尿酸血症是痛风的生化基础，以尿酸升高为典型特点，尿酸浓度一旦超过生理范围，就会引起各种病理反应，如氧化应激、线粒体功能障碍及形态絮乱、细胞凋亡、炎症等〔2～5〕。其中，线粒体损伤是高尿酸血症的重要机制之一。肾小管上皮细胞中有丰富的线粒体，尿酸可诱导线粒体超氧化物的生成增加，过量的活性氧(ROS)会导致线粒体损伤，受损的线粒体可诱导凋亡信号传导，从而导致细胞的凋亡造成肾小管损伤〔6〕。目前，高尿酸血症及肾小管损伤已成为肾脏疾病研究的重点与热点。研究发现水蛭素具有缓解肾纤维化及保护肾损伤作用〔7〕，但集中于水蛭素对尿酸引起的肾小管上皮细胞氧化应激反应及细胞凋亡的作用鲜见报道。本研究通过体外构建高尿酸诱导的肾小管细胞损伤模型，探讨不同浓度水蛭素对尿酸诱导肾小管损伤的修复及线粒体调节作用。

1 材料和方法

1.1材料和试剂 水蛭素的制备：将吸饱2%氯化钠的金边蚂蟥活体放置在容器中，加入适量硫酸锌和乙醇混合液，收集金边蚂蟥活体吐出的唾液(天然水蛭素提取液)，纯化后加入辅料后进行冷冻干燥，获得的粉末即天然水蛭素(质量分数为96%，凝血酶滴定约为500 ATU/g)，蒸馏水稀释制备含水蛭素200 ATU/g溶液，备用。主要仪器：CO2恒温培养箱(Thermo，美国，型号：311)；移液器(Thermo，美国，型号：F3)；酶标仪(杭州奥盛仪器有限公司，中国，型号：AMR-100)；倒置荧光显微镜(Leica，德国，型号：DMIL LED)。线粒体膜电位检测试剂盒(上海碧云天生物技术有限公司，中国，货号：C2006)。细胞：大鼠肾细胞NRK-52E采购自中国科学院上海细胞库。主要试剂：尿酸、别嘌醇购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；凋亡检测试剂盒购自BD公司；乳酸脱氢酶(LDH)测定试剂盒购自南京建成生物工程研究所；葡萄糖测定试剂盒购自上海荣盛生物药业有限公司。

1.2CCK8检测细胞活性 收集细胞，调整细胞悬液浓度，分于96孔板，5×103个细胞/孔，每孔180 μl，每种细胞每块板接种3个同样的孔作为复孔，置37℃、5%CO2培养箱中培养过夜，使细胞贴壁。以0.0、0.1、0.3、0.6、1.2 mmol/L的尿酸培养细胞48 h，筛选尿酸的浓度。按照6、12、24 h不同时间处理细胞，进行筛选得到水蛭素的最适干预条件为10 mmol/L处理12 h。

1.3细胞分组和处理 细胞复苏后被分为正常组、模型组(1.2 mmol/L尿酸)、药物干预组(1.2 mmol/L尿酸+10 mmol/L水蛭素)、阳性药物组(1.2 mmol/L尿酸+10 mmol/L别嘌醇)。药物干预24 h后，再以尿酸作用24 h。

1.4流式细胞术检测ROS含量 按照1∶1 000用无血清培养液稀释2′,7′-二氯荧光素二乙酸酯(DCFH-DA)，使终浓度为10 μmol/L。细胞收集后悬浮于稀释好的DCFH-DA中，细胞浓度为1×107/ml，37℃细胞培养箱内孵育20 min。每隔3～5 min颠倒混匀一下，使探针和细胞充分接触。用无血清细胞培养液洗涤细胞3次，以充分去除未进入细胞内的DCFH-DA。收集各组细胞，上流式细胞仪检测ROS。使用NovoCyte分析软件进行分析。

1.5流式细胞术检测细胞凋亡率 把细胞培养液吸出，磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤，加入胰酶细胞消化液消化。室温孵育，吸除胰酶细胞消化液。加入收集细胞培养液，混匀，转移到离心管内，400 r/min离心5 min，弃上清，收集细胞，用PBS轻轻重悬细胞并计数。加入1 ml预冷PBS，轻轻震荡使细胞悬浮，400 r/min，4℃离心5 min，弃上清；重复洗涤3次；将细胞重悬于200 μl结合缓冲液；加入10 μl膜联蛋白V-异硫氰酸荧光素(Annexin V-FITC)和10 μl碘化丙啶(PI)，轻轻混匀，4℃避光孵育30 min；加入300 μl结合缓冲液，随即进行流式细胞仪检测。使用NovoExpress分析软件进行分析。

1.6电镜观察细胞线粒体形态 取1×107个细胞，175 r/min离心5 min，令细胞沉于管底部，吸除上清液，立即加2 ml 2.5%戊二醛固定，固定30 min以上送检，取适量0.1 mol/L PBS清洗3次，每次10 min。1%锇酸固定，固定1 h，取适量0.1 mol/L PBS清洗3次，每次10 min。常规脱蜡，包埋，切片。醋酸铀避光染色20 min，然后夹出铜网用双蒸水洗3次，吸干。再用枸橼酸铅避光染色15 min，夹出载网，用双蒸水洗去多余铅液。透射电镜观察、拍照。

1.7JC-1染色检测细胞线粒体膜电位变化 取1×106个细胞，重悬于0.5 ml细胞培养液中。加入0.5 ml JC-1染色工作液，轻轻吹打混匀。在37℃、5% CO2细胞培养箱中孵育20 min。孵育结束后，400 r/min 4℃离心3 min，沉淀细胞，弃上清。用JC-1染色缓冲液洗涤2次：加入1 ml JC-1染色缓冲液重悬细胞，400 r/min，4℃离心3 min，沉淀细胞，弃上清。重复2次。加入400 μl JC-1染色缓冲液重悬细胞，上机检测。使用NovoCyte分析软件进行分析。

1.8统计学分析 采用SPSS22.0软件进行单因素方差分析。

2 结 果

2.1尿酸浓度的筛选 CCK8检测不同浓度尿酸处理的细胞增殖率，流式检测不同浓度的尿酸处理细胞的凋亡率，见表1。当处理浓度为1.2 mmol/L时，细胞增殖率高于60%，且凋亡率小于30%。在所测试的范围内，细胞的凋亡率最高，细胞增殖率最低，因此本实验选1.2 mmol/L为适宜浓度。

表1 尿酸作用浓度筛选

2.2水蛭素抑制尿酸诱导的大鼠肾NRK-52E凋亡 流式检测各组细胞凋亡率，见图1。和正常组〔(6.19±0.17)%〕比较，模型组细胞凋亡率〔(31.80±1.04)%〕显著升高(P<0.05)；和模型组比较，药物干预组〔(21.72±1.06)%〕和阳性药物组的凋亡率〔(20.72±1.15)%〕均显著降低(P<0.05)。

2.3水蛭素降低尿酸诱导的大鼠肾NRK-52E的ROS水平 流式检测各组细胞ROS水平，见图2。和正常组〔(5.90±0.52)%〕比较，模型组细胞ROS水平〔(28.92±0.79)%〕显著升高 (P<0.05〕；和模型组比较，药物干预组〔(16.97±0.77)%〕和阳性药物组的ROS水平〔(18.21±0.45)%〕均显著降低(P<0.05)。

图1 流式检测各组肾NRK-52E的凋亡率

图2 流式检测各组NRK-52E ROS水平

2.4水蛭素缓解尿酸诱导的大鼠肾NRK-52E细胞的线粒体结构变化与膜电位下降 透射电镜观察各组细胞线粒体形态变化，见图3。正常组线粒体形态完整，线粒体内部脊和基质完整，排列有序；模型组的细胞线粒体肿胀，内部基质密度减小，脊出现断裂或者消失；药物干预组和阳性药物组以上症状有所缓解。JC-1染色检测各组细胞线粒体膜电位变化，见图4。和正常组〔(10.79±0.98)%〕比较，模型组膜电位降低的细胞比例〔(41.22±2.37)%〕显著增多(P<0.05〕；和模型组比较，药物干预组〔(20.54±0.93)%〕和阳性药物组的膜电位下降的细胞比例〔(21.92±0.45)%〕显著减少(P<0.05)。

图3 电镜观察大鼠肾NRK-52E细胞线粒体形态(×8 000)

图4 JC-1染色检测大鼠肾NRK-52E细胞线粒体膜电位变化

3 讨 论

尿酸是微溶于水的晶体结构的阴离子有机酸，是嘌呤类物质在人体内经黄嘌呤氧化酶(XOD)作用代谢的终产物〔8〕。人体内70%的尿酸从肾脏排泄，要经历肾小管的重吸收和再分泌过程。最后只有约10%的尿酸由肾小球滤过并排出体外。尿酸在体内的生成与代谢平衡被破坏，尿酸蓄积会导致高尿酸血症，从而引发肾损伤〔9，10〕。金边蚂蟥，壮药称之堵平怀，为医蛭科动物菲牛蛭的干燥全体。作为一种珍贵的广西壮药，在民间常用于痛风病症的治疗，疗效确切，被广大患者所接受。前期研究发现，金边蚂蟥能显著降低高尿酸血症小鼠血液尿酸水平和正常小鼠尿酸水平，且毒性低使用安全〔11〕。进一步研究发现，金边蚂蟥活性物质水蛭素可降低高尿酸血症小鼠血清中的尿酸水平，同时，还可降低由氧嗪酸钾引起的慢性高尿酸小鼠血清高尿酸水平，降低血清尿酸氮水平，改善模型小鼠的肾脏病理学改变〔12，13〕。综合上述实验，本研究进一步探索水蛭素对尿酸引起的肾损伤的作用。

氧化反应本是维持正常机体代谢所必须的生理过程。ROS是由氧激发的化学性质十分活泼的分子，是诱发氧化应激的重要因素〔14～16〕。在正常情况下，人体内ROS的产生和清除处于动态平衡，当机体受到某些因素刺激处于应激状态时，体内氧化与抗氧化作用失衡，细胞内ROS升高超过其清除能力，在体内蓄积引起细胞氧化应激〔17〕。邓蓉等〔18〕研究表明，尿酸能提高NRK-52E中ROS含量，导致细胞氧化及抗氧化系统失衡。本研究结果提示水蛭素提高了细胞的抗氧化能力，缓解氧化应激反应。

线粒体是真核生物中重要的细胞器，通过氧化呼吸作用为细胞生命活动提供所需要的能量。线粒体在氧化应激中起着重要作用，线粒体既是氧化应激的重要来源，又是氧化应激的靶向细胞器〔19，20〕。氧化应激能够造成线粒体本身结构的变化，使线粒体功能障碍，三磷酸腺苷(ATP)合成阻滞，线粒体膜通透性转换孔道开放，线粒体膜通透性增加，线粒体膜电位崩溃，进而促进线粒体释放凋亡诱导因子，最终导致细胞凋亡〔21，22〕。本研究从水蛭素对线粒体损伤的影响进一步探索水蛭素通过增强细胞抗氧化能力保护NRK-52E的作用机制。本研究结果说明模型组细胞中ROS的上升，造成了线粒体的损伤，从而激活线粒体细胞凋亡途径，诱导细胞凋亡，而水蛭素预处理后的细胞ROS水平降低，线粒体结构紊乱程度有所改善，膜电位下降的细胞减少。