廖源 屈萌艰 刘静 钟培瑞 曾亚华 王婷 张青秀 肖豪 李兰 刘丹妮 杨璐 周君

(1广州中医药大学针灸康复临床医学院，广东 广州 510006；南华大学附属第一医院 2康复医学中心；3康复医学科；4康复医学实验室)

急性肺损伤(ALI)是指心源性以外的各种肺内、外致病因素导致的急性、进行性、缺氧性呼吸衰竭〔1〕。ALI 的实质是一个炎症反应和毛细血管通透性增加的综合征〔2〕，细胞黏附分子(CAMs)介导的炎性损伤机制在ALI病理生理过程中的作用越来越受到重视。其家族成员细胞间黏附分子(ICAM)-1可介导炎症反应中白细胞跨内皮迁徙及向炎症部位的积聚过程〔3〕，故对于ICAM-1研究也越来越多。超短波治疗是一种高频电磁场的物理因子治疗，可减轻人体炎症反应。研究报道〔4〕，联合使用超短波治疗肺部感染，其疗效较单独使用抗生素好，尤其在坠积性肺炎、慢性阻塞性肺疾病等方面的抗炎效果明显〔5～9〕，但鲜见超短波在ALI中应用。本研究拟探讨超短波对脂多糖(LPS)诱导的大鼠ALI炎症反应及ICAM-1表达的影响。

1 材料与方法

1.1实验动物分组 24只3月龄体重为(429.72±44.00)g的清洁级雄性SD大鼠，从湖南省斯莱克景达实验动物有限公司购买〔实验动物合格证号：SCXK(湘)2019-0004〕，实验大鼠饲养于湖南省衡阳市南华大学动物实验部，分笼饲养，饲养在温度20～25℃，湿度50%～60%，12 h间隔照明的环境中，予以自由摄食和饮水，适应性饲养1 w。在整个动物实验过程中，严格遵循中华人民共和国颁布的《实验动物管理条例》。

1.2主要实验物品 LPS(北京Solarbio公司)，白细胞介素(IL)-6、转化生长因子(TGF)-β、酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒(Proteintech公司)，全自动酶标洗板机(深圳市汇松科技发展有限公司)，多功能酶标分析仪(深圳市汇松科技发展有限公司)，台式冷冻离心机(中国湖南湘仪公司)，切片机(德国LEICA 公司)，电热恒温培养箱(北京市永光明医疗仪器有限公司)，奥林巴斯光学显微镜(日本奥林巴斯株式会社)，电泳仪、电泳槽、转膜仪(中国北京六一公司)，磁力搅拌器(中国雷磁公司)，旋涡混合器(中国江苏其林贝尔公司)，生物样品均质仪(中国杭州奥盛)。

1.3主要材料及试剂 1.5 mol/L三羟甲基氨基甲烷盐酸盐(Tris HCl)(pH8.8)溶液、1 mol/L Tris HCL溶液(美国Sigma公司)，10%过硫酸铵溶液(中国上海国药公司)，1.74 mg/ml苯甲基磺酰氟(PMSF)溶液、10%十二烷基硫酸钠(SDS)溶液(中国大连美伦公司)、30%亚甲基双丙烯酰胺(Acr/Bic)液(中国北京金泰宏达公司、美国Sigma公司),10%丽春红染液(中国上海国药公司),还原型5%上样缓冲液、电泳液缓冲液、转膜缓冲液(美国Sigma公司),三乙醇胺缓冲盐水溶液(TBS)缓冲液、磷酸盐吐温缓冲液(PBST)缓冲液、封闭液(中国盐城赛宝公司)。

1.4实验方法

1.4.1实验动物分组 24只大鼠随机分为3组(每组8只)：对照组、ALI组、超短波组。

1.4.2实验动物造模 实验大鼠称重后，按3 ml/kg剂量腹腔注射10%水合氯醛麻醉大鼠，仰卧位固定大鼠，颈部备皮，消毒后沿颈部正中线切开皮肤、剥离皮下组织、暴露气管，用1 ml注射器刺入气管内按5 mg/kg体重缓慢滴注LPS(浓度为5 mg/ml)，滴注完毕将动物直立5 s，逐层缝合伤口，再次络合碘消毒。对照组同样方法暴露气管，滴注等量生理盐水。

1.4.3实验干预 对照组、ALI组不干预，超短波组在大鼠滴注LPS即刻、4 h、8 h给予超短波干预，共干预3次。采用 CDB-1超短波电疗机(上海医疗器械高技术公司生产)，刺激强度为50 mA，电极板面积为290 mm×200 mm，胸背对置,两个电极板之间距离为11 cm，预热5 min，干预15 min/次。

1.5标本检测

1.5.1肺组织湿重(W)/干重(D)比值测定 在气管内滴注LPS或生理盐水24 h后，麻醉实验动物后，取右上肺组织检测肺组织W/D比值：肺组织置于干净锡箔纸上，马上用干净滤纸吸干肺组织表面水分，然后将肺组织连同锡箔纸一起置于玻璃瓶中精确称质量后W，再将肺组织连同锡箔纸置于60℃恒温箱中烘烤48 h后测定肺组织D，计算出肺组织 W/D比值评估肺组织水肿程度。

1.5.2用苏木素-伊红(HE)染色进行病理学观察和肺组织损伤评分 在气管内滴注LPS或生理盐水24 h后，麻醉实验动物，取左下肺组织进行HE染色、病理评估。肺组织损伤评分标准〔4〕：①肺泡充血,②出血,③肺泡腔或血管壁中性粒细胞浸润或聚集,④肺泡壁增厚和(或)透明膜形成4 项指标，分别依病变轻重评为0～4分(0分指无病变或非常轻微病变；1分为轻度病变；2分为中度病变；3分为重度病变；4 分为极重度病变)，总分16分。4 项评定分数总和为肺组织病理半定量的总评分。

1.5.3ELISA检测血清IL-6、TGF-β水平 在气管内滴注LPS或生理盐水24 h后，麻醉实验动物，眼眶取血后，处死动物。全血标本于室温放置2 h，于4℃ 2 000 g离心15 min，取上清液，-80℃保存，以备ELISA检测。ICAM-1正义链：5′-CTGCCTCTGC TCCTGGTCCTG-3′，反义链：5′-CATCCAGTTAGTCT CCAACCCC-3′，171 bp；β-actin正义链：5′-ACATCCGTAAAGACCTCTATGCC-3′，反义链：5′-TACTCCTGCTTGCTGATCCAC-3′，223 bp。

1.5.4Western印迹检测ICAM-1蛋白的表达 在气管内滴注LPS或生理盐水24 h后，麻醉实验动物，取右下肺组织放入冻存管，迅速转移至液氮罐中低温保存，用于Western印迹检测。

1.6统计学分析 采用SPSS23.0软件进行单因素方差分析。

2 结 果

2.1肺组织HE染色及肺组织损伤评分 肺组织HE染色结果显示：对照组肺组织结构基本正常；ALI组肺组织可见大量中性粒细胞浸润、聚集，有少量红细胞渗出，肺泡壁变厚断裂，肺泡结构破坏明显；超短波组肺泡结构相对急性肺损伤组完整，肺组织间中性粒细胞浸润明显减少，红细胞渗出减少。见图1。肺组织损伤评分：ALI组较对照组明显升高(P<0.01)；超短波组较ALI组明显减低(P<0.01)。见表1。

2.2肺组织W/D比值比较 ALI组W/D比值较对照组明显升高(P<0.01)，超短波组与ALI组相比，比值有减低，但差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

2.3血清IL-6、TGF-β水平 ALI组IL-6较对照组明显升高(P<0.01)，超短波组较ALI组明显减低(P<0.05)；ALI组TGF-β较对照组明显降低(P<0.01)，超短波组较ALI组明显升高(P<0.05)。见表1。

图1 ALI大鼠肺组织病理切片(HE染色，×200)

表1 各组W/D比值、IL-6及TGF-β水平、ICAM-1 mRNA及蛋白表达、肺组织损伤评分比较

2.4ICAM-1 mRNA的表达 ALI组ICAM-1 mRNA表达较对照组明显升高(P<0.01)，超短波组较ALI组明显降低(P<0.01)。见表1。

2.5Western印迹检测ICAM-1蛋白的表达 急性肺损伤组的肺组织ICAM-1蛋白表达较对照组明显升高(P<0.01)，超短波组较急性肺损伤组明显降低(P<0.01)。见表1、图2。

图2 肺组织ICAM-1蛋白的表达

3 讨 论

ALI是临床常见的呼吸系统疾病之一〔10〕，临床以气道及肺实质内的急性炎症反应为主要特点，重者可转为急性呼吸窘迫综合征(ARDS)，从而直接导致死亡的发生。ALI和ARDS的重要病理变化是过度炎症反应，严重损伤肺毛细血管内皮细胞及肺泡上皮〔11,12〕。

ALI目前比较公认的机制是各种病因诱导肺内促炎因子生成增加，由多种炎性介质及效应细胞共同参与，并呈瀑布样炎性继发性损伤与继发性弥漫性肺实质损伤〔13〕。由此可见如何处理炎症反应是治疗ALI的关键。超短波治疗具有扩张血管，使血管壁通透性增高，改善血液循环，促进炎症吸收，减轻水肿，增强组织营养，加强局部组织代谢的生理效应〔14〕，常常运用到临床各种炎症的治疗方案中，尤其是用于肺部的炎症的对症处理〔5～9〕。

IL在免疫细胞的成熟、活化、增殖和免疫调节等一系列过程中均发挥重要作用。IL-6是炎症急性期合成的重要介质，参与肺部炎症病理过程〔15,16〕，并且能反映肺炎严重程度〔17～19〕。TGF-β属于转化生长因子-β超家族成员之一，以其能促进细胞生长和分化而得名〔20〕，是一种多功能细胞因子，具有促进血管生成、组织修复，调控免疫调节、调控炎症反应等多种生理功能〔21,22〕。TGF-β主要通过抑制促炎因子的表达、抑制炎症细胞的增殖、促进免疫抑制因子的表达、抑制白细胞的生成，从而达到抗炎的作用〔23～26〕。本研究结果反映ALI发生了明显的炎症反应，超短波可以抑制ALI大鼠的炎症反应；超短波能上调TGF-β水平发挥抗炎作用。

ICAM-1是一种具有多种生物功能的跨膜糖蛋白，属于免疫球蛋白超家族成员〔27〕，能介导细胞黏附、趋化、淋巴细胞归巢等作用，参与炎症和免疫反应，通常以配体和受体相结合的方式发挥作用，调节白细胞的功能活性和免疫反应。ICAM-1还参与传递胞外-胞内信号，使胞内蛋白磷酸化、诱导蛋白激酶和转录因子活化，从而产生大量的生物学活性〔28,29〕。正常时ICAM-1呈现较低的表达,而在细胞因子如IL-1、肿瘤坏死因子(TNF)的作用下表达增强〔30〕。本研究结果提示ICAM-1参与ALI的发生过程，经过超短波治疗后ICAM-1 mRNA及蛋白的表达水平均有明显下降。ICAM-1升高与下降的趋势与血清IL-6水平、病理结果和肺组织损伤评分的变化是一致的。综上，超短波可通过下调ICAM-1的表达，抑制ALI大鼠肺组织的炎症反应。