高芳 卫星如 马立聪 田旭阳 党彤 贾彦彬,

(1包头医学院，内蒙古 包头 014060；2包头医学院第二附属医院内蒙古消化病研究所)

幽门螺杆菌(H.pylori)是定植于胃黏膜、含有鞭毛蛋白特殊结构的需氧革兰阴性菌。世界卫生组织将H.pylori确定为胃的Ⅰ类致癌原〔1〕。Toll样受体(TLR)5是一种可识别细菌鞭毛蛋白〔2,3〕的模式识别受体，表达于胃上皮细胞膜的表面〔4〕。H.pylori感染机体后可引起慢性萎缩性胃炎、消化性溃疡、胃癌等一系列胃肠道疾病〔5〕。而H.pylori感染人体后，宿主胃黏膜上皮中TLR5的表达水平上调〔6,7〕。研究证实，TLRs基因多态性在一定程度上可以影响宿主对H.pylori感染及相关疾病的遗传易感性〔8〕。此外，TLR5可能参与了H.pylori感染后各种胃部疾病的发生发展〔9〕，甚至引起胃癌的发生。在我们前期研究TLR5基因多态性与H.pylori的感染、非贲门胃癌的发病风险中发现，包头地区汉族人群中TLR5基因单核苷酸多态性(SNP)rs17163737与H.pylori、非贲门胃癌的发病风险相关联〔10，11〕。由于单一基因多态性在癌变的过程中起微效效应，TLR5基因其余的单核苷酸多态性是否也和胃癌变有关还需进一步探索，本研究探讨TLR5基因SNP rs5744138、rs2241096、rs160827 rs20961-41、rs160812基因多态性与H.pylori感染、非贲门胃癌的关系。

1 材料与方法

1.1研究样本 选取2008年9月至2010年6月间包头市肿瘤医院经组织病理学诊断为非贲门胃癌的患者288例为病例组，均未接受过放疗或化疗。再选取281例同期在包头医学院第一附属医院无癌症病史和明显的胃部疾病的体检者为正常对照组。两组年龄、性别差异无统计学意义(t=0.40，P=0.69；χ2=0.06，P=0.80)。研究对象均为汉族，相互之间无血缘关系且在包头居住5年以上，签署了知情同意书，并提供血液标本2 ml。本研究已获得包头医学院伦理学委员会的批准。

1.2H.pylori感染的检测 采用酶联免疫吸附试验(ELISA)血清学方法，在正常对照组血清中检测人抗H.pylori的抗体滴度。试剂盒购于(BIOHIT公司，芬兰)，严格按照说明书进行操作。并根据试剂盒推荐：抗体滴度≥30 EIU，判断H.pylori感染为阳性。

1.3SNP位点的筛选和基因分型 采用Agorithm-Tagger-pairwise Tagging软件，根据HapMap数据库(http://hapmap.ncbi.nlm.nih.gov/)提供的中国汉族遗传多态性数据，筛选研究基因的标记单核苷酸多态性(Tag-SNP)〔11〕。筛选范围包括基因第一个外显子上游20 kb和最后一个外显子下游10 kb的序列。筛选过程中使用的参数为连锁不平衡值r2>0.8，最小等位基因频率(MAF)>5%。最终本研究筛选出TLR5 rs5744138、rs2241096、rs160827 rs2096141、rs160812的5个位点，见表1。对5个SNP采用TaqMan法在所有样本中进行基因分型，成功率均大于98%。

表1 TLR5基因的Tag-SNPs的概况

1)频率低的等位基因在前，频率高的等位基因在后;2)基于GRCh37.p10

1.4统计学分析 数据分析使用SPSS 16.0统计软件进行。在正常对照组中用χ2检验检测样本中的基因型分布是否遵循Hardy-Weinberg平衡；使用Haploview4.0软件对SNP位点进行连锁不平衡分析，并采用D′置信区间法划分单体型块(LD block)。TLR5单体型块包括rs34270714-rs5744174-rs851139-rs2241097-rs17163737(Block 1)、rs574413-8-rs2241096-rs1640827-rs2096141-rs160812(Block 2)之间存在强连锁不平衡，分别构成单体型区域。在我们先前的实验中，已经对Block 1进行了研究〔11〕。本实验我们重点研究了Block 2。

用非条件性Logistic回归计算比值比(OR)及其95%可信区间(CI)，评价各等位基因、基因型及单体型与H.pylori感染、非贲门胃癌发病风险的关联性〔10,11〕。

2 结 果

2.1各SNP位点与H.pylori感染的关系 SNP rs5744138、rs2241096、rs160827、rs2096141、rs160812的基因型分布在H.pylori感染阴性组和阳性组均符合Hardy Weinberg平衡定律(P>0.05)。H.pylori的阳性率为43.3%。5个SNP位点的等位基因、基因型在H.pylori感染阳性和阴性人群中的分布差异无统计学意义(P>0.05)，见表2。

表2 各SNP位点等位基因、基因型与H.pylori感染的关联

1)数据有缺失，2)平衡了性别和年龄因素；表3同

2.2各SNP位点与非贲门胃癌发病风险的关系 所有检测的SNP的等位基因、基因型频率在两组中的分布差异无统计学意义(P>0.05)，见表3。

2.3TLR5基因的单体型与H.pylori感染的关系 以H.pylori感染为结局变量，使用Haploview软件对TLR5基因的不同位点进行连锁不平衡分析，单体型块的划分采用D′置信区间法，发现rs5744138-rs2241096-rs1640827-rs2096141(Block)之间存在强连锁不平衡，构成单体型区域。分析结果显示，各单体型在H.pylori感染阳性和阴性人群中的分布差异无统计学意义(P>0.05)，见表4。

2.4TLR5基因的单体型与非贲门胃癌发生的关系 以非贲门胃癌为结局变量，使用Haploview软件对TLR5基因的不同位点进行连锁不平衡分析，单体型块的划分采用D′置信区间法，发现rs5744138-rs2241096-rs1640827-rs2096141-rs1640812(Block)之间存在强连锁不平衡，分别构成单体型区域。分析结果显示，各单体型在两组中的分布差异无统计学意义(P>0.05)，见表5。

表3 各SNP位点等位基因、基因型与非贲门胃癌的关联分析

表4 TLR5基因单体型与H.pylor感染的关系

SNP顺序为rs5744138-rs2241096-rs1640827-rs2096141

表5 TLR5基因单体型与非贲门胃癌的关系

SNP顺序为rs5744138-rs2241096-rs1640827-rs2096141-rs1640812

3 讨 论

胃癌是常见的恶性肿瘤之一，其发生发展过程受多种环境因素和遗传因素的影响。H.pylori感染是引起胃黏膜病变的生物致病因子之一，可导致慢性胃炎尤其是慢性活动性胃炎的发生和进展，部分患者可进展为消化性溃疡、萎缩性胃炎、胃癌等严重临床结局〔12,13〕。

TLRs是一种模式识别受体，能够特异性地识别细菌、病毒等多种病原微生物，进而激活机体产生非特异性免疫应答。TLRs的表达具有组织特异性，其中TLR2、TLR4、TLR5和TLR9在胃中有选择性表达〔8〕。TLR5是TLRs中唯一可以识别细菌蛋白质的受体，其配体是细菌的鞭毛蛋白〔2,3〕。研究发现，在H.pylori感染者当中10%～20%的患者会发展成消化性溃疡，发展成为胃癌的比例仅占1%～2%〔14〕，说明宿主的遗传因素在胃癌的发生发展过程中发挥了重要作用。TLRs在H.pylori感染及其引起的相关疾病中起到了重要的作用，其编码基因是研究H.pylori感染及其相关疾病分子遗传学的重要候选基因〔15,16〕。

TLR5基因位于染色体1q41-q42，编码TLR5蛋白质。Hayashi等〔17〕证实了先天免疫系统对H.pylori感染的识别主要是通过细菌鞭毛蛋白和TLR5之间的相互作用。Xu等〔16〕研究显示，TLR5基因SNP rs1640827和rs17163737与H.pylori感染相关联。卫星如等〔18〕研究表明，在共显性遗传模式下，TLR5基因SNP rs2072493与H.pylori的感染关联，与AA基因型携带者相比，携带AG基因型者可使H.pylori感染的风险降低。而有研究表明〔10〕，TLR5 rs17163737与H.pylori感染关联。H.pylori感染属于多基因疾病，环境、遗传因素都在疾病的发展中起一定的作用。单一SNP起微效效应。结果提示TLR5 rs5744138、rs2241096、rs160827 rs2096141、rs160812与H.pylori感染没有关联。目前，关于这5个SNP与H.pylori感染、胃癌的发病风险的研究报道不多，还需进一步研究证实。

本研究还探讨了TLR5基因多态性与非贲门胃癌发病风险的关系。研究结果显示，SNP rs5744138、rs2241096、rs160827 rs2096141、rs160812位点的等位基因、基因型频率在非贲门胃癌病人和正常对照中的分布差异无统计学意义。Xu等〔16〕研究显示，TLR5基因SNP rs5744174、rs1640827和rs17163737与GC发病风险上升。同时TLR5基因多态性可能增加萎缩性胃炎和胃癌的发病风险〔19〕。而有研究表明〔11〕，TLR5基因SNP rs17163737与非贲门胃癌的发病风险相关联，与携带GG基因型的人群比较，GT基因型携带者非贲门胃癌的发病风险可提高1.605倍(GT vs GG:OR=1.605,95%CI=1.131～2.280)，SNP rs34270714、rs5744174、rs851139与非贲门胃癌发病风险没有关联(P>0.05)。单个SNP在胃癌的发病过程作用是微小的。今后应进一步扩大样本量，研究在胃癌变过程中，基因多态性的联合效应。