钱朋智，张梅娟，王韬，郭宏文，王艳菊，甄珍

（1.齐齐哈尔大学食品与生物工程学院，黑龙江 齐齐哈尔 161006；2.齐齐哈尔大学生命科学与农林学院，黑龙江 齐齐哈尔 161006；3.黑龙江省哈尔滨市海关技术中心齐齐哈尔综合实验室，黑龙江 齐齐哈尔 161000）

蛹虫草[Cordyceps militaris（L.ex Fr.）Link.]，又名北虫草、北冬虫夏草，为子囊菌亚门（Ascomycotina）麦角菌目（Clavicipitales）麦角菌科（Clavicipitaceae）虫草属（Cordyceps）真菌，是重要的食药两用真菌，可与冬虫夏草相媲美。在我国，蛹虫草目前已大规模种植，广泛分布于广东、山东、辽宁、吉林等地[1]。2009年我国卫生部正式将蛹虫草批准为新资源食品，2014年更名为“新食品原料”[2]。

蛹虫草含有虫草素、虫草多糖、麦角甾醇和纤溶酶等多种天然生物活性物质[3-4]。虫草素是核苷类物质，其含量是衡量蛹虫草质量的标准之一[5-7]；此外，虫草素具有抗肿瘤、抗菌抗病毒、免疫调节、清除自由基等多种药理作用[8]；有研究发现，蛹虫草中含有虫草素和喷司他丁两种独特的有效成分，是冬虫夏草的良好替代品[3，9]。虫草多糖是主要由甘露糖、半乳糖和葡萄糖等组成的多聚糖，是蛹虫草活性物质中重要的物质，具有免疫调节、抗肿瘤、抗氧化等作用[1，10]。麦角甾醇是微生物细胞膜的重要组成部分，是具有生物活性的化合物；蛹虫草麦角甾醇在抑菌、降脂、防肿瘤、免疫调节等方面具有显著功效[11-12]。纤溶酶是能专一降解纤维蛋白凝胶的蛋白水解酶，蛹虫草纤溶酶具有溶栓抗脂等生物活性功能[2，13]。

作为一种“新食品原料”，蛹虫草的营养和保健功能越来越受到人们的认可[14]，而对其活性成分进行评价能更好地反映其内在品质。谷物是培养蛹虫草的原料之一，具有来源广泛、价格低廉、质量可靠等优点。不同谷物的营养成分和理化性质有一定差异，培养所得的蛹虫草菌丝共生体或子实体中功能成分含量不同。目前，人工栽培的蛹虫草子实体大多选用大米、小麦等培养基质，固体基质较单一，且目标多为提高子实体中的虫草素含量，对其他活性物质如粗多糖、麦角甾醇和纤溶酶的研究相对较少；而且市场上蛹虫草的活性成分差异较大，对蛹虫草产业的发展造成了一定的影响[1]。培育蛹虫草菌丝共生体或子实体的目的：一是直接用于产品的开发制备，二是对蛹虫草培养过程中产生的代谢产物进行提取和利用。培养含有特定活性物质和功能的蛹虫草产品，是蛹虫草产业发展的必然趋势。而合适的培养基对蛹虫草菌丝共生体或子实体的生长及活性物质的合成具有促进作用。因此，本研究以高粱[Sorghum bicolor（L.）Moench]、糜子（Panicum miliaceum L.）和油莎豆（Cyperus esculentus L.）3 种谷物为培养基质，接种蛹虫草液体菌种，检测不同培养基质中蛹虫草菌丝共生体和子实体的主要有效活性成分含量，以期为蛹虫草优良品质以及产品开发提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

高粱、糜子、油莎豆（均为食品级）：产于齐齐哈尔市泰来县；蛹虫草斜面菌种（母种）：齐齐哈尔大学食品与生物工程学院微生物研究室。

虫草素标准品（≥98%）、麦角甾醇标准品（≥98%）：上海源叶生物科技有限公司；苯酚、高锰酸钾、葡萄糖、浓硫酸（均为分析纯）：北京索莱宝生物科技有限公司；草酸、甲醇、乙醇（均为色谱纯）：国药集团化学试剂有限公司；牛血纤维蛋白原、牛凝血酶（500 U/mL）：中国医学科学院天津血液研究所。

谷物培养基质的配制：分别向耐高温（140℃）高压玻璃罩栽培器中添加高粱、糜子和油莎豆各100 g，并添加适量水，121℃高压0.1 MPa灭菌1 h，冷却至25℃备用。

液体菌种培养基的配制：称取马铃薯20 g，加水100 mL，在加热器上加热至沸腾，用纱布进行过滤。向滤液中加入葡萄糖2 g，定容至100 mL，121℃高压0.1 MPa灭菌15 min，冷却至25℃备用。

1.2 仪器与设备

立式压力蒸汽灭菌器（LDZX）：上海申安医疗器械有限公司；电热恒温鼓风干燥箱（DHG-9243BS-Ⅲ）：上海新苗仪器有限公司；多功能小型粉碎机（J-02）：上海淀久中药机械制造有限公司；超声波清洗器（Q-600B）：昆山市超声仪器有限公司；台式离心机（TDL-80-2B）：上海安亭科学仪器厂；超纯水制备仪（Millipore）：密理博有限公司；紫外可见分光光度计（TU-1901）：北京普析通用仪器有限公司；高效液相色谱仪（Agilent 1290）：美国安捷伦公司。

1.3 方法

1.3.1 液体菌种的制备

无菌条件下，用无菌接种铲在斜面母种处取0.5cm×0.5 cm菌种10块，放至250 mL液体菌种培养基中，在温度23℃、150 r/min的条件下培养3 d～4 d，待培养基中出现颗粒均匀的球状菌丝且菌液澄清透明、无分层后停止培养，得到的菌液即为蛹虫草液体菌种。

1.3.2 高粱、糜子和油莎豆培育蛹虫草试验

1.3.2.1 菌丝共生体培养

无菌条件下，将液体菌种接种于3种谷物培养基质上，接种量为2.5%（即液体种子的体积占培养料湿料质量的百分比）。接种后放入无菌栽培室中，避光培养。培养条件为温度18℃、湿度60%。菌丝萌发后定期观察并记录菌丝生长情况，直至菌丝布满整个培养基质时停止培养，此时得到的谷物培养基质和菌丝体共存的整体即为谷物蛹虫草菌丝共生体，简称菌丝共生体。检测菌丝共生体中的虫草素含量、粗多糖含量、麦角甾醇含量和纤溶酶酶活。

1.3.2.2 子实体培养

将布满菌丝体的培养基质继续进行培养，培养条件为温度20℃、湿度80%，每天通风2次，上下午各一次，每次1 h～2 h，直至子实体成熟。采摘后检测子实体中的虫草素含量、虫草粗多糖含量、麦角甾醇含量和纤溶酶酶活。

1.3.3 蛹虫草活性物质检测

1.3.3.1 粗多糖含量的测定

粗多糖含量参照戚梦等[15]的方法进行检测。

1.3.3.2 虫草素含量的测定

虫草素含量参照NY/T 2116—2012《虫草制品中虫草素和腺苷的测定 高效液相色谱法》中的方法进行检测。

1.3.3.3 麦角甾醇含量的测定

麦角甾醇含量参照T/HZBX 026—2019《真菌及其制品中麦角甾醇的测定高效液相色谱法》中的方法进行检测。

1.3.3.4 纤溶酶酶活的测定

按料液比1∶2（g/mL），在菌丝共生体、子实体中分别加入适量去离子水，4℃静止浸提6 h，6 000 r/min离心5 min，收集上清液。参考王明瑞等[2]的方法进行纤溶酶酶活的测定。

1.4 数据处理

试验数据的统计分析采用Excel和SPSS 20.0软件，差异显著性的分析采用单因素方差和最小显著差（least significance difference test，LSD）检验法，显著性水平设定为P＜0.05。作图采用Origin 8.0软件。

2 结果与分析

2.1 不同培养基质对蛹虫草菌丝共生体中不同有效成分的影响

2.1.1 不同谷物培养基质对菌丝共生体粗多糖含量的影响

多糖是虫草菌中的一种主要活性物质，其合成过程与栽培原料成分差异、蛹虫草发育阶段、细胞内物质代谢及途径等有关[16-17]。不同培养基质对蛹虫草菌丝共生体粗多糖含量的影响见图1。

图1 不同谷物培养基质对菌丝共生体粗多糖含量的影响Fig.1 Effects of different medium on crude polysaccharide content of C.militias mycelial symbiote

由图1可知，在相同试验条件下，不同培养基质上菌丝共生体的粗多糖含量不同，且差异显著（P＜0.05）。其中，糜子培养基质培养的菌丝共生体中粗多糖含量最高，为72.50 mg/g；油莎豆培养基质培养出的菌丝共生体中粗多糖含量最低，为21.93 mg/g；高粱培养基质培养出的菌丝共生体中粗多糖含量为47.77 mg/g，介于糜子和油莎豆之间。常亚娜[18]通过对不同工艺条件下杂粮蛹虫草菌质成分的分析发现，当麦仁和糙米质量比为1∶2，并添加一定量大豆匀浆液和奶粉，光照时间27 d时，多糖含量可达68.02 mg/g，低于本研究的糜子培养基质中粗多糖的含量。分析原因可能是不同培养基质所含营养成分的种类、含量不同，可供蛹虫草菌丝生长所需的营养物质也不同，而且不同来源的菌株合成多糖的过程可能也会不同，最终导致蛹虫草菌质虫草粗多糖的含量各异。

2.1.2 不同谷物培养基质对蛹虫草菌丝共生体虫草素含量的影响

虫草素是蛹虫草中特有的活性成分，有良好的应用前景[18]。虫草素的合成与蛹虫草的生长基质密切相关。不同谷物培养基质对菌丝共生体虫草素含量的影响见图2。

图2 不同谷物培养基质对菌丝共生体虫草素含量的影响Fig.2 Effects of different medium on cordycepin content of C.militias mycelial symbiote

由图2可知，在相同培养条件下，油莎豆蛹虫草菌丝共生体中的虫草素含量最高，为3.93 mg/g，糜子培养基中的虫草素含量次之，为2.24 mg/g，高粱培养基中的含量最低，为1.09 mg/g。常正姣[19]以麦仁、糙米、大豆匀浆液和奶粉为培养基质得出虫草素含量为6.01 mg/g，略高于本研究油莎豆培养基质中虫草素含量，分析原因可能是不同基质来源和不同菌株影响了蛹虫草菌丝体中虫草素的合成。

2.1.3 不同谷物培养基质对蛹虫草菌丝共生体麦角甾醇含量的影响

影响食用菌中麦角甾醇含量的因素有很多，如遗传因素、生长环境、生长基质、生长时间、生长阶段和菌种来源等[20]。不同培养基对蛹虫草菌丝共生体麦角甾醇含量的影响见图3。

图3 不同谷物培养基质对菌丝共生体麦角甾醇含量的影响Fig.3 Effects of different medium on ergosterol content of C.militias mycelial symbiote

由图3可知，在相同栽培条件下，菌丝共生体中的麦角甾醇含量受接种培养基质的影响，且差异显著（P＜0.05）。油莎豆蛹虫草菌丝共生体的麦角甾醇含量最低，为0.39 mg/g，其次是糜子，为0.76 mg/g，在高粱培养基质中含量最高可达1.38 mg/g，是油莎豆的3.54倍，推测可能是因为高粱的组成成分与糜子、油莎豆的成分不一致。

2.1.4 不同谷物培养基质对蛹虫草菌丝共生体纤溶酶酶活的影响

不同培养基对蛹虫草菌丝共生体纤溶酶酶活的影响见图4。

图4 不同谷物培养基质对菌丝共生体纤溶酶酶活的影响Fig.4 Effects of different medium fibrinolyti enzyme activity of C.militias mycelial symbiote

由图4可知，高粱和糜子培养基质中菌丝共生体的纤溶酶酶活分别为108.42 U/g和95.81 U/g，在油莎豆培养基质中最高，可达312.26 U/g，分别为高粱和糜子的2.88倍和3.26倍，这可能是因为油莎豆粒径大，加大了与空气的接触面积，有效增加了发酵界面，有利于培养基质的有效利用，促进了纤溶酶的产生。

2.2 不同谷物培养基质对蛹虫草子实体不同有效成分的影响

2.2.1 不同谷物培养基质对蛹虫草子实体粗多糖含量的影响

多糖是评价虫草产品优良的一个重要指标[21]，蛹虫草子实体中合成多糖的能力因培养基的不同而不同。不同谷物培养基质对蛹虫草子实体粗多糖含量的影响见图5。

图5 不同谷物培养基质对蛹虫草子实体粗多糖含量的影响Fig.5 Effects of different medium on crude polysaccharide content of C.militias fruiting bodies

由图5可知，油莎豆培养基质上合成粗多糖的能力显著高于糜子和高粱培养基质，粗多糖含量分别为糜子和高粱培养基质的1.82倍和2.96倍。研究发现，3种谷物培养基质中，蛹虫草子实体中的粗多糖含量均比菌丝共生体中的含量低。因此，糜子蛹虫草菌丝共生体粗多糖具有良好的开发和应用潜力，可用于普通人群或特殊人群的膳食替代。本结果与常亚娜[18]的研究观点基本一致。

2.2.2 不同谷物培养基质对蛹虫草子实体虫草素含量的影响

不同谷物培养基质对蛹虫草子实体虫草素含量的影响见图6。

图6 不同谷物培养基质对蛹虫草子实体虫草素含量的影响Fig.6 Effects of different medium on cordycepin content of C.militias fruiting bodies

由图6可知，油莎豆培养基质的虫草素含量最高，为7.34 mg/g，糜子培养基质次之，为5.45 mg/g，高粱培养基质最低，为4.33 mg/g，但均高于相应培养基质上的菌丝体中虫草素含量。乐昕等[22]研究高粱米作为培养基质的蛹虫草子实体中，虫草素含量为2.482 mg/g，低于本研究中虫草素的含量，推测不同的菌种和培养条件可能会导致蛹虫草子实体虫草素含量上的差异。研究表明，子实体中虫草素含量高于谷物蛹虫草菌丝共生体，因此选择油莎豆培养基质培养子实体体更有利于虫草素的合成。

2.2.3 不同谷物培养基质对蛹虫草子实体麦角甾醇含量的影响

不同谷物培养基质对蛹虫草子实体麦角甾醇含量的影响见图7。

图7 不同谷物培养基质对蛹虫草子实体麦角甾醇含量的影响Fig.7 Effects of different medium on ergosterol content of C.militias fruiting bodies

由图7可知，高粱培养基质上培养的子实体中的麦角甾醇含量最高，油莎豆最低，二者相差3.25 mg/g。子实体中麦角甾醇含量均高于相应培养基质上的菌丝共生体中麦角甾醇含量。结果表明，高粱培养基质培养子实体最有利于麦角甾醇的合成。

2.2.4 不同谷物培养基质对蛹虫草子实体纤溶酶酶活的影响

不同谷物培养基质对蛹虫草子实体纤溶酶酶活的影响见图8。

图8 不同谷物培养基质对蛹虫草子实体纤溶酶酶活的影响Fig.8 Effects of different medium on fibrinolyti enzyme activity of C.militias fruiting bodies

由图8可知，油莎豆培养基质最有利于产纤溶酶，酶活可达140.1 U/g，其次为糜子培养基质，然后是高粱培养基质。相比菌丝共生体产纤溶酶的能力，油莎豆培养基质降低了55.13%，高粱培养基质降低了32.18%，而糜子培养基质仅降低了5.49%。研究表明，菌丝共生体中纤溶酶酶活高于子实体，油莎豆蛹虫草菌丝共生体更有利于纤溶酶的产生。

3 结论

本研究将液体菌种分别接至高粱、糜子、油莎豆3种谷物栽培培养基质中，培育蛹虫草产品，研究不同阶段的指标特征。结果表明，不同培养基质对蛹虫草菌丝共生体和子实体的粗多糖、虫草素、麦角甾醇和纤溶酶酶活均有影响。高粱培养基质培养蛹虫草子实体麦角甾醇含量最高，为6.10 mg/g，是菌丝共生体的4.42倍；糜子培养基质培养的菌丝共生体粗多糖含量最高，为72.50 mg/g；油莎豆培养基质中菌丝共生体产纤溶酶酶活最高，为312.26 U/g，子实体虫草素含量最高，为7.34 mg/g。因此，高粱适合作为培养高产麦角甾醇的蛹虫草子实体的培养基质，糜子可作为培养高产粗多糖的菌丝共生体的培养基质，油莎豆可作为高产虫草素的子实体和高产纤溶酶的菌丝共生体的培养基质。

总之，蛹虫草的各种活性成分与所用培养基质、菌株来源等多种因素相关。选择适宜的培养基质，培养含有特定有效成分的蛹虫草产品，可为开发多种具有不同主体功能的谷物蛹虫草食品提供依据。