左婕，费烨，李佳慧，肖怡，王筑婷，许庆忠，李红梅

（贵州医科大学基础医学院生物化学与分子生物学教研室，贵州 贵阳 550025）

2型糖尿病（type 2 diabetes mellitus，T2DM）已成为威胁全球健康的最常见的慢性代谢性疾病，其特征是胰岛素抵抗和相对胰岛素不足[1]。国际糖尿病联合会（International Diabetes Federation，IDF）估计，2019 年全球糖尿病患病率为9.3%（4.63亿人），到2030年将增加到10.2%（5.78亿人），到2045年将增加到10.9%（7亿人）[2]。T2DM患者发生严重并发症的风险增加，包括大血管并发症（心血管疾病）和微血管并发症（肾病、神经病变和视网膜病变）[3]。近年来，在糖尿病防治和血糖管理领域取得巨大的进步，但并发症的患病率仍然是T2DM患者面临的一个重要问题[4]。目前，还没有治愈糖尿病的药物，T2DM的首选治疗方法包括使用降糖药物（如双胍类、磺脲类药物等）和生活方式干预（健康营养和日常体力活动）。

近年来，新的天然化合物以其高效、来源广泛、价廉、无副作用等特点在治疗T2DM方面取得了重大的进展[5-7]。在这些化合物中，从食品蛋白中提取的天然活性肽因其具有多种生物活性和较高的安全性而受到众多研究人员的关注。苦荞是一种独特的食药两用粮食作物，因其具有较高的营养价值和药用价值，越来越受到人们的重视[8]。苦荞活性肽P3（P3肽）是一个由5个氨基酸（Ala-Phe-Tyr-Arg-Trp）组成的具有抗氧化活性的小肽，是课题组前期通过碱性蛋白酶酶解苦荞清蛋白分离纯化得到的，其分子量大小为741.8 Da[9]。P3肽稳定性好，活性受外界环境影响小，而且没有毒性作用[10]。本研究观察P3肽在体外对α-葡萄糖苷酶活性的影响，并在链脲佐菌素（streptozotocin,STZ）诱导糖尿病小鼠动物模型的基础上，探讨P3肽对糖尿病小鼠的影响，为P3肽进一步的开发利用提供参考。

1 材料与方法

1.1 主要试剂与材料

1.1.1 实验动物

60只SPF级C57/BL6雄性小鼠：体重为18g～20g，购自贵州医科大学动物实验中心，许可证号为SYXK（黔）-0001。

1.1.2 试剂

P3肽（色谱纯）：上海淘普生物科技有限公司；α-葡萄糖苷酶（分析纯）：上海源叶生物科技有限公司；链脲佐菌素（分析纯）：美国Sigma公司；葡萄糖测定试剂盒、甘油三酯（triglyceride，TG）测定试剂盒、总胆固醇（total cholesterol，TC）测定试剂盒、高密度脂蛋白（high density lipoprotein，HDL-C）测定试剂盒、低密度脂蛋白（low density lipoprotein，LDL-C）测定试剂盒：南京建成生物工程研究所；吡格列酮（分析纯）、BCA蛋白定量试剂盒：北京Solarbio公司；磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol3-kinase,PI3K）、蛋白激酶 B（Akt）、磷酸化蛋白激酶B[p-Akt（Ser473）]、葡萄糖转运蛋白（glucose transporter 4，GLUT4）、胰岛素底物受体 1（insulin recptor substrate-1，IRS1）、β-肌动蛋白（β-actin）：武汉Proteintech公司；磷酸化胰岛素底物受体1[p-IRS1（Ser307）]：美国 Cell Signaling Technology 公司；辣根过氧化物酶标记羊抗兔IgG、辣根过氧化物酶标记羊抗鼠IgG：美国Jackson Immuno-Research公司。

1.2 主要仪器与设备

血糖仪（安稳型）、血糖试纸（Ⅰ型）：长沙Sannou公司；多功能酶标仪（H4）、凝胶成像仪（Gel Doc XR）：美国Bio-Tek公司；台式离心机（TGL-16B）：上海安亭科学仪器厂；电子天平（CP214）：奥豪斯仪器有限公司；蛋白垂直电泳仪（DYCZ-24D）、稳压稳流电泳仪（DYY-6C型）：北京六一仪器厂。

1.3 方法

1.3.1 α-葡萄糖苷酶体外抑制实验

设置空白背景组、空白组、样品背景组、样品组，在96孔板中进行实验。以P3肽为抑制剂，样品组和样品背景组每组 P3 肽浓度依次为 0.25、0.50、1.00、2.00、4.00、8.00、10.00 mg/mL，α-葡萄糖苷酶浓度为 0.8 U/mL。相应试剂的添加顺序见表1。加入磷酸盐缓冲液（phosphate buffer solution,PBS）、P3 肽、对硝基苯基-α-D-吡喃葡萄糖苷（p-nitrophenyl-α-D-glucopyranoside，PNPG）和α-葡萄糖苷酶进行反应；碳酸钠终止反应后，在波长405 nm处测定吸光度。按照计算公式计算抑制率。

表1 α-葡萄糖苷酶体外抑制实验Table 1 Inhibition of α-glucosidase in vitro μL

1.3.2 糖尿病小鼠模型的建立

糖尿病小鼠模型参加文献[11]的方法建立并进行适当改进。准备5周龄的C57/BL6雄性小鼠。基础饲料中加入20%蔗糖和10%猪油配制成高热量饲料。高热量饲料喂养小鼠4周后，空腹注射STZ。按照50 mg/kg STZ剂量连续3 d腹腔注射。一周后，小鼠尾静脉取血，使用血糖仪测小鼠空腹8 h的血糖浓度。若血糖浓度大于7 mmol/L，即糖尿病模型建造成功。

1.3.3 实验分组与药物干预

选取正常小鼠10只，建模成功糖尿病小鼠50只，分为空白组、模型组、阳性药物组（每天吡格列酮20 mg/kg灌胃）、P3肽低剂量组（P3肽5 mg/kg每日腹腔注射，简写成低-P3）、中剂量组（P3肽10 mg/kg每日腹腔注射，简写成中-P3）、高剂量组（P3肽20 mg/kg每日腹腔注射，简写成高-P3）。空白组给予基础饲料喂养，模型组和各药物组高热量饲料喂养，药物干预4周。

1.3.4 糖耐量实验

给药干预4周后，口服糖耐量实验（oral glucose tolerance test,OGTT）法检测每组小鼠糖耐量情况。每组小鼠断食不断水8 h，精准称取各组小鼠体重，葡萄糖溶液2.5 g/kg灌胃。然后血糖仪测量0、30、60、120、180 min的小鼠尾尖血，记录数值。

1.3.5 小鼠血脂检测

药物干预4周后，空腹处理各组小鼠8 h。取小鼠眼球血3 500 r/min离心10 min，收集上清液。按照葡萄糖、血脂测定试剂盒说明书进行操作，测量血清葡萄糖、TG、TC、LDL-C和HDL-C。

1.3.6 检测胰岛素信号通路相关蛋白表达情况

药物干预4周后，处死各组小鼠，取小鼠肝脏，然后称取100 mg肝脏组织进行蛋白提取。将称取的肝脏组织置于玻璃匀浆器中，每管加入300 μL组织裂解液[50 mmol/L Tris-HCl（pH7.4）、150 mmol/L NaCl、1%乙基苯基聚乙二醇（Nonidet P 40，NP-40）、0.1%十二烷基磺酸钠（sodium dodecyl sulfonate，SDS）]，并加入 3 μL苯甲基磺酰氟（phenylmethylsulfonyl fluoride，PMSF）和3 μL蛋白磷酸酶抑制剂。冰上研磨裂解20 min，收集匀浆于EP管中，4℃、12 000 r/min离心10 min，收集上清液进行蛋白定量。取蛋白样品30 μg进行电泳，转膜、封闭、加入抗 IRS1、Akt、PI3K、GLUT4、p-IRS1、p-Akt抗体孵育。洗涤后根据上述蛋白的一抗种属选择加入相应的羊抗兔或羊抗鼠二抗。孵育、洗涤后与发光液避光充分反应，曝光后扫描，用Image J 1.5.2进行光密度分析。

1.4 统计分析

试验重复3次，试验数据以平均值±标准差表示，采用SPSS 19.0软件进行统计分析，采用单因素方差分析对多组进行比较，P＜0.05具有统计学意义。

2 结果与分析

2.1 P3肽对α-葡萄糖苷酶活性的影响

体内的α-葡萄糖苷酶可水解碳水化合物中的葡萄糖苷键，释放葡萄糖。抑制α-葡萄糖苷酶活性可减缓餐后血糖的升高。采用不同浓度的P3肽作用于α-葡萄糖苷酶，结果见图1。

图1 P3肽对α-葡萄糖苷酶活性的影响Fig.1 The effect of peptide P3 onα-glucosidase activity

由图1可知，给予P3肽干预后，与空白组对比，各组α-葡萄糖苷酶活性降低，差异极显著（P＜0.01）。并且P3肽浓度为0.25 mg/mL～8.00 mg/mL时，随着P3肽浓度的升高，α-葡萄糖苷酶活性逐渐降低。在P3肽浓度为1.00 mg/mL时，对α-葡萄糖苷酶活性的抑制率可以达到50%。结果显示P3肽可以抑制α-葡萄糖苷酶的活性。

2.2 P3肽对糖尿病小鼠糖耐量的影响

OGTT在临床上常被用于检测有无糖代谢异常。药物干预4周后，OGTT法检测各组小鼠糖耐量，记录0、30、60、120、180 min 血糖变化，计算不同实验组小鼠糖耐量曲线下行面积（area under curve，AUC），结果见图2。

图2 苦荞活性肽P3对C57/BL6糖尿病小鼠糖耐量的影响Fig.2 Effect of peptide P3 on glucose tolerance C57/BL6 diabetic mice

由图2A可知，模型组0～180 min内各时间点血糖值均高于空白组；阳性药组以及P3肽组0～180 min内各时间点血糖均低于模型组。如图2B所示，相对于空白组，模型组糖耐量升高，差异极显著（P＜0.01）。与模型组相比，阳性药物组小鼠糖耐量显著改善（P＜0.05）；P3肽组小鼠中剂量组的糖耐量显著改善（P＜0.05），高剂量组的糖耐量得到明显改善，差异极显著（P＜0.01），且呈剂量依赖性。结果表明通过腹腔注射P3肽可以明显改善糖尿病小鼠糖耐量异常的情况。

2.3 P3肽对糖尿病C57/BL6小鼠血糖的影响

空腹血糖是临床上糖尿病最常见的检测指标，可反映胰腺β细胞功能，一般代表基础胰岛素的分泌功能。给药干预4周后，空腹处理各组小鼠8 h。取小鼠眼球血，3 500 r/min离心10 min，取上层血清，按照葡萄糖测定试剂盒说明书检测各组小鼠血糖含量，结果见图3。

图3 苦荞活性肽P3对C57/BL6糖尿病小鼠空腹血糖的影响Fig.3 Effect of peptide P3 on fasting blood glucose C57/BL6 diabetic mice

由图3可知，与空白组相比，模型组小鼠空腹血糖升高，差异极显著（P＜0.01）；与模型组相比，阳性药物组小鼠空腹血糖显著下降（P＜0.05），P3肽组小鼠中剂量组、高剂量组的空腹血糖下降尤为明显，差异极显著（P＜0.01）。结果表明P3肽具有改善C57/BL6糖尿病小鼠高血糖的作用。

2.4 P3肽对糖尿病C57/BL6小鼠血脂的影响

胰岛素抵抗及糖尿病发展过程中常伴随着血脂代谢紊乱。按照各血脂测定试剂盒说明书检测各组小鼠 TG、TC、LDL-C、HDL-C 含量，结果见图4。

图4 P3肽对C57/BL6糖尿病小鼠血脂的影响Fig.4 Effect of peptide P3 on blood lipid in C57/BL6 diabetic mice

由图4可知，与空白组相比，模型组小鼠TG、TC明显升高，差异极显著（P＜0.01）；LDL-C 显著升高（P＜0.05），HDL-C 明显降低，差异极显著（P＜0.01）。与模型组相比，阳性药物组TG明显降低，差异极显著（P＜0.01），P3肽组小鼠低剂量组TG显著降低（P＜0.05），中剂量组、高剂量组TG明显降低，差异极显著（P＜0.01），呈剂量依赖性；与模型组相比，阳性药物组TC显著降低（P＜0.05），P3肽组小鼠中剂量组 TC 显著降低（P＜0.05），高剂量组TC明显降低，差异极显著（P＜0.01），呈剂量依赖性；相对模型组，阳性药物组LDL-C显著降低（P＜0.05），P3肽组小鼠低剂量组、高剂量组LDL-C明显降低，差异极显著（P＜0.01），中剂量组LDL-C显著降低（P＜0.05）；相对模型组，阳性药物组HDL-C明显升高，差异极显著（P＜0.01），P3肽组小鼠低剂量组、高剂量组HDL-C显著升高（P＜0.05），中剂量组HDL-C明显升高，差异极显著（P＜0.01）。结果表示P3肽具有改善糖尿病小鼠血脂代谢异常的作用。

2.5 P3肽对糖尿病C57/BL6小鼠肝脏组织胰岛素信号通路相关蛋白表达的影响

葡萄糖的转运通过多种胰岛素信号通路发生，其中，PI3K/Akt在胰岛素的代谢中起着重要的作用。本研究采用Western blotting检测了小鼠肝组织中PI3K/Akt通路中相关蛋白的表达，结果见图5。

图5 苦荞活性肽P3对C57/BL6糖尿病小鼠肝脏胰岛素信号通路相关蛋白的影响Fig.5 Effect of peptide P3 on insulin signal pathway related proteins in liver of C57/BL6 diabetic mice

由图5可知，各组小鼠肝脏组织IRS1、Akt表达均无明显差异。与空白组小鼠比较，模型组小鼠肝脏组织 p-IRS1（Ser307）水平升高，差异极显著（P＜0.01）；而PI3K、GLUT4的表达明显下调，差异极显著（P＜0.01），p-Akt（Ser473）水平降低，差异极显著（P＜0.01）。说明C57/BL6糖尿病小鼠的肝脏组织胰岛素信号通路相关蛋白表达受阻，形成了胰岛素抵抗。经药物干预后，相对模型组，阳性药物组p-IRS1（Ser307）水平明显降低，差异极显著（P＜0.01），P3肽组小鼠低剂量组p-IRS1（Ser307）水平显著降低（P＜0.05），中剂量组、高剂量组的p-IRS1水平明显降低，差异极显著（P＜0.01），呈剂量依赖性；相对模型组，P3肽各剂量组小鼠肝组织中PI3K表达上调，差异极显著（P＜0.01）；相对模型组，P3肽各剂量组小鼠肝组织中GLUT4表达上调，差异极显著（P＜0.01），呈剂量依赖性；相对模型组，P3肽组小鼠中剂量组、高剂量组的p-Akt（Ser473）水平升高，差异极显著（P＜0.01），呈剂量依赖性。结果表明P3肽具有介导C57/BL6糖尿病小鼠肝脏组织胰岛素信号通路相关蛋白的表达，改善胰岛素抵抗的作用。

3 讨论与结论

糖尿病是一种以高血糖为主要临床表现的慢性疾病，其特征是机体不能产生胰岛素（1型糖尿病）或胰岛素作用缺陷（2型糖尿病）[12]。肥胖、高脂血症和炎症等代谢紊乱常伴随糖尿病的发生[13-14]。

餐后血液中葡萄糖的主要来源之一是吸收从碳水化合物中消化的葡萄糖[15]。通常食物中的碳水化合物会被α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶等消化酶水解为葡萄糖后被机体吸收[16]。研究报道，来源于各种食物蛋白的生物活性肽可抑制水解碳水化合物的消化酶，这是控制餐后高血糖的有效策略[17]。本研究中P3肽在体外可明显抑制α-葡萄糖苷酶的活性，可能具有降低餐后血糖的能力。但是P3肽的序列中有被胰蛋白酶识别并水解的赖氨酸，如果口服P3肽，可能会在肠道中被水解而失去其对α-葡萄糖苷酶的抑制活性。因此，本研究采用腹腔注射P3肽，以观察它对糖尿病小鼠的作用。

本研究通过高热量饮食及注射STZ诱导形成T2DM糖尿病小鼠模型，连续给予P3肽干预4周，观察P3肽对糖尿病小鼠糖耐量、血糖及血脂的影响，结果发现P3肽可减轻糖尿病小鼠的葡萄糖耐量、降低血糖、改善血脂紊乱。胰岛素抵抗（insulin resistance,IR）即胰岛素敏感性降低，是导致T2DM的主要原因。改善肝脏IR被认为是治疗T2DM的重要途径。葡萄糖的转运通过各种胰岛素信号途径进行，其中包括PI3K、Akt和GLUT4等蛋白质组成的PI3K/Akt/GLUT4的信号通路与葡萄糖的吸收和代谢密切相关[18]。GLUT4是一个含有跨膜域的蛋白质，静息状态下，GLUT4位于细胞质中。当血糖水平升高，胰岛素结合并激活胰岛素受体，促进IRS1的酪氨酸磷酸化，从而激活PI3K和Akt，激活的PI3K/Akt促进GLUT4转位至细胞膜，促进细胞对葡萄糖的摄取，并最终降低血糖水平[19-20]。研究认为IR的形成主要是由于胰岛素信号转导通路受阻，或者通路中关键蛋白作用减弱而使胰岛素不能发挥其正常的生理作用[21]。IRS1蛋白的丝氨酸/苏氨酸磷酸化被认为是IR的分子基础[22-23]，IRS1的丝氨酸磷酸化，特别是Ser307和Ser636/639上的丝氨酸磷酸化后，可抑制IRS1的酪氨酸磷酸化[24]。在本研究中，P3肽可逆转糖尿病小鼠肝脏组织中的IRS1蛋白Ser307磷酸化水平的升高、调节胰岛素信号转导、激活PI3K/Akt信号通路增加GLUT4的表达，从而增加细胞对葡萄糖的摄取。

综上所述，本研究的结果表明，P3肽可抑制α-葡萄糖苷酶的活性，降低糖尿病小鼠血糖、改善糖尿病小鼠的糖耐量和血脂紊乱，通过抑制IRS1蛋白Ser307磷酸化，激活PI3K/Akt信号通路，增加GLUT4的表达，进而增加细胞对葡萄糖的摄取，从而改善IR。P3肽可用于防治糖尿病的药物开发。