王 丹，韩甜甜，赵明义

(1.辽宁大学 药学院，辽宁 沈阳 110036；2.沈阳市儿童医院 输血科，辽宁 沈阳 110032)

0 引言

自噬(Autophagy)是真核生物对细胞内物质进行循环再利用的主要进化机制，是溶酶体对受损蛋白以及细胞器降解的主要形式之一，以维持细胞新陈代谢和机体动态平衡[1].营养匮乏、缺氧、DNA受损等应激刺激均可激发细胞自噬[2].目前研究表明自噬有3种类型，分别是巨自噬(Macroautophagy)、微自噬(Microautophagy)和分子伴侣介导的自噬(Chaperone-mediated autophagy)[3].巨自噬是自噬方式中最为常见的一种，在真核细胞中普遍存在[2].自噬在维持人类身体健康、防治疾病等方面发挥着重要作用，并参与机体的多种生理病理过程，与细胞衰老[4]、机体自身免疫性疾病[5]、神经退行性疾病[6]以及癌症[7]等疾病均有密切关系.

土槿皮为松科植物金钱松Pseudolarixamabilis的干燥根皮或近根树皮，其性温、味辛、有毒，归肺、脾经.土槿皮具有杀虫、止痒的功效，清代赵学敏所著《本草纲目拾遗》已有土槿皮治疗皮肤癣症的记录，现有外用复方土槿皮酊用于治疗由真菌感染的皮肤病.土槿皮的主要化学成分土槿乙酸(Pseudolaric acid B，PAB)是从金钱松的根皮或近根树皮中分离提取的主要成分之一，为一种二萜类酸，分子式为C23H28O8，化学结构如图1.该化合物具有抗炎[8]、抗真菌[9]、调节免疫[10]、抗肿瘤[11]等作用，具体机制为抑制肿瘤细胞异常增殖、细胞周期阻滞、诱导细胞凋亡及调节信号通路等[12]，且PAB还可能通过触发细胞自噬的方式发挥药理活性.PAB作为一种微管蛋白结合剂，还可与微管蛋白结合，破坏细胞骨架稳定性，抑制血管生成[13].研究发现其他二萜化合物如鼠尾草酸(Carnosic acid，CA)、雷公藤甲素(Triptolide，TP)、蓝萼甲素(Glaucocalyxin，GL)等也可通过调控细胞自噬的途径发挥功效.本文主要综述二萜化合物土槿乙酸触发细胞自噬的研究进展.

图1 土槿乙酸的分子结构

1 PAB触发细胞自噬的作用

1.1 PAB触发小鼠成纤维L929细胞自噬

研究表明，PAB作用于小鼠成纤维L929细胞后以时间和剂量依赖的方式抑制细胞的增殖，上调自噬相关蛋白Beclin-1表达，使微管蛋白由LC3-Ⅰ转化为LC3-Ⅱ，提示PAB通过细胞自噬的方式抑制细胞增殖[14].且PAB通过激活蛋白激酶C(PKC)活性，诱导细胞周期阻滞、促进活性氧(ROS)生成、诱导线粒体功能障碍等触发细胞自噬，引起衰老[15-16].另有研究证明[17]PAB通过触发ROS-JNK-p53通路，抑制mTOR活性，进而抑制由Akt-mTOR途径引发的L929细胞自噬，减缓衰老.

1.2 PAB触发人甲状腺鳞状癌细胞SW579自噬

PAB作为一种抗微管蛋白药物，可以通过干扰α-微管蛋白聚合，以时间和剂量依赖的方式抑制人甲状腺鳞状癌细胞SW579的生长.PAB可导致微管纤维聚集，使细胞形态受损，并有效抑制细胞迁移.PAB可将细胞周期阻滞于G2/M期.单丹磺酰尸胺(MDC)染色实验发现黄绿色荧光增加，提示自噬标志物增加.自噬抑制剂3-MA处理细胞后，细胞自噬被抑制，细胞存活率降低，说明PAB可通过触发细胞自噬抑制SW579细胞生长.因此PAB可作为治疗原发性甲状腺鳞状细胞癌的候选药物[18].

1.3 PAB触发人肺成纤维细胞MRC5自噬

在对小鼠成纤维细胞L929和人甲状腺鳞状癌细胞SW579的研究发现，PAB仅诱导细胞发生自噬，不诱导L929和SW579细胞凋亡.在研究PAB对人肺成纤维细胞MRC5的影响时，得出了同样的结论.PAB处理MRC5细胞后，观察细胞形态未见凋亡小体或细胞核凝聚，在DNA梯形实验中，发现PAB作用36 h后未见DNA梯带，由此得出结论PAB不诱导MRC5细胞发生凋亡.另外用4 μmol/L PAB处理MRC5细胞，MDC染色后发现自噬标志物增加.应用Western-Blot方法检测自噬相关蛋白Beclin-1和LC3的表达情况，研究发现Beclin-1蛋白表达增加，LC3-Ⅰ转化为LC3-Ⅱ，以上结果表明PAB诱导MRC5细胞发生自噬现象效果显著.当与自噬抑制剂3-MA联合使用后，研究者发现PAB通过上调p-JNK、caspase-3及下调p-ERK蛋白表达诱导细胞凋亡，且在此过程中对PAB的微管聚集能力无显著影响.这可能为PAB在抗肿瘤治疗研究方面提供了一种新策略[19].

1.4 PAB触发人乳腺癌细胞MCF-7自噬

已发表的文献证明，PAB对人乳腺癌细胞MCF-7细胞具有细胞毒性[20].但并不是所有的细胞都在PAB处理后死亡，而是有一部分细胞经3 d PAB处理后仍然存活.且PAB以时间和剂量依赖的方式诱导MCF-7细胞凋亡及触发其自噬发生.研究者采用4 μmol/L PAB处理36 h，自噬体染料MDC染色显示自噬标记物增加.Western-Blot实验结果表明经PAB处理后，MCF-7细胞中自噬相关蛋白Beclin-1和LC3-Ⅱ的表达增加[21].与单独使用PAB相比，PAB与自噬抑制剂3-MA联合使用后，细胞自噬率降低，凋亡率升高，提示自噬促进细胞存活.这也许就是经PAB处理后仍有一部分细胞存活的原因.PAB处理细胞后，线粒体膜电位无影响，Bcl-2表达增加.此外PAB抑制Bcl-2与Beclin-1结合，从而释放Beclin-1参与自噬.因此，在PAB对人乳腺癌细胞MCF-7的作用中，会同时触发细胞自噬和诱导细胞凋亡.提示，在临床应用PAB治疗乳腺癌疾病时，联合使用PAB和自噬抑制剂可能会提高治疗效果.

1.5 PAB触发前列腺癌细胞PC-3自噬

PAB通过激活JNK通路诱导前列腺癌PC-3细胞周期阻滞于G2/M期以及诱导细胞凋亡.Western-Blot实验结果表明PAB作用PC-3细胞后Beclin-1和LC3-Ⅱ蛋白表达上调，而p-Akt、p-mTOR等蛋白表达降低，提示PAB可抑制Akt-mTOR通路，触发PC-3细胞自噬.此外，PAB还通过激活JNK通路而使前列腺癌细胞对Bcl-2抑制剂(ABT-737)增敏，抵抗其产生的细胞毒副作用.另外研究者采用雄激素依赖性前列腺癌细胞株LNCaP检测PAB的抗前列腺癌活性，发现PAB对LNCaP有剂量依赖性的抑制作用.证明PAB对雄激素依赖性和非依赖性前列腺癌细胞均有较强的抑制增殖作用[22].此外，最近一项研究表明，PAB可通过降解Bcl-2，诱导激素非依赖性前列腺癌细胞DU145凋亡[23].这使PAB有望成为一种有潜力的治疗前列腺癌的候选药物.

1.6 PAB触发人肺癌细胞A146自噬

卢政霞等[24]利用四甲基偶氮唑蓝(MTT)分析法、MDC荧光染色法、流式细胞仪分析法等考察了PAB对人肺癌细胞A146的影响，研究发现PAB作用于A146细胞后，细胞数目明显减少；MDC荧光染色呈亮绿色，提示自噬标志物增加；流式细胞仪结果显示，加入PAB后，MDC阳性率增加，Western-Blot实验结果显示PAB激发自噬相关蛋白Beclin-1表达，伴随LC3转型.由此得出PAB可诱发A146细胞产生细胞自噬，且自噬在抑制A146细胞生长增殖中发挥了关键作用.

1.7 PAB触发人卵巢癌细胞HO-8910自噬

王佳贺等[25]通过探讨PAB对人卵巢癌细胞HO-8910自噬的作用机制，发现PAB作用于HO-8910后，细胞存活率显著降低，Western-Blot实验结果表明Beclin-1和LC3-Ⅱ的表达增加，而p-Akt、p-mTOR等蛋白表达下调，另外加入3-甲基腺嘌呤(3-MA)和雷帕霉素(RAPA)后，发现3-MA对自噬相关蛋白起抑制作用，而RAPA促进自噬相关蛋白的表达.得出PAB可通过抑制PI3K/Akt/mTOR通路诱导卵巢癌细胞HO-8910引发自噬.

2 PAB触发细胞自噬的可能的分子机制

根据上述的PAB触发多种细胞发生自噬情况，其具体的作用机制主要为以下3种，分别是PI3K/Akt/mTOR信号通路、JNK信号通路、Beclin-1信号通路.

2.1 PI3K/Akt/mTOR通路

PI3K/Akt/mTOR通路是较为重要的一条信号通路，在细胞凋亡、细胞增殖中均起着关键作用，该通路也参与Tau蛋白的调节.mTOR是一种经典的自噬调节因子，在自噬中起到了枢纽作用.对早期阿尔茨海默病(AD)患者研究发现，该信号通路处于激动状态[26].因此可通过抑制该通路，增强自噬-溶酶体功能，减轻AD症状[27].大量研究表明PAB可通过抑制该信号通路，激发细胞自噬，发挥药理活性.王佳贺等[25]通过探讨PAB对卵巢癌细胞HO-8910自噬的作用机制，发现PAB可通过抑制PI3K/Akt/mTOR通路诱导卵巢癌细胞HO-8910引发自噬.Qi等[17]同样发现PAB可通过抑制Akt-mTOR通路激发L929细胞自噬，起到减缓衰老的效果.Jing等[22]探究PAB对PC-3作用时，发现PAB通过抑制Akt-mTOR通路，激活PC-3细胞自噬.

2.2 JNK通路

JNK是促分裂素原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases，MAPK)家族的成员之一，研究显示JNK通路与mTOR存在密切联系.有研究发现PAB可通过触发ROS-JNK-p53通路，抑制mTOR活性[17]；PAB也可激活JNK通路而使前列腺癌细胞对ABT-737增敏，从而释放Beclin-1参与自噬[22].

2.3 Beclin-1信号通路

Beclin-1蛋白作为一种自噬相关蛋白，通常可与人Ⅲ型磷酸肌醇-3-激酶(human type Ⅲ phosphatidylinositol 3-kinase，hVps34)、自噬相关蛋白Atg14及p150形成PI3KC3复合物，然而，抗凋亡蛋白Bcl-2可与Beclin-1结合进而抑制由Beclin-1蛋白介导的细胞自噬.在氧气匮乏、饥饿等特殊情况下，Bcl-2发生磷酸化，并从该复合物中解离，释放Beclin-1蛋白从而诱导自噬[28].研究表明PAB可激活Beclin-1蛋白表达上调，触发自噬发生[24].

3 展望

本文主要综述了二萜化合物PAB可触发多种细胞自噬发生及其可能的分子机制.世界卫生组织发布的最新数据显示，AD已成为全球十大死亡原因之一.AD的发病机制与大脑中β淀粉样蛋白异常积累沉积[29]、Tau蛋白过度磷酸化[30]、脑组织内细胞因子水平较高表达、炎症基因表达上调[31]有关.研究表明在治疗AD中多采用自噬-溶酶体途径降解异常蛋白.细胞自噬可有效清除异常蛋白，也可通过调节细胞因子分泌参与炎性反应[32].

其他二萜化合物如CA、TP、GL等也可通过调节细胞信号通路的方式调控细胞自噬，清除异常蛋白，发挥抗AD活性.CA可通过调节细胞自噬的方式发挥其在治疗神经退行性疾病中的作用[33].实验证明，在由Aβ25-35诱导的AD模型中，CA可显著降低细胞死亡，提高细胞存活率，且呈现剂量时间依赖性诱导细胞发生自噬，对由Aβ25-35引起的神经元损伤起保护作用[34].TP作为一类高效的自噬诱导剂，通过自噬途径可有效清除各种类型的α-突触核蛋白，避免沉积[35].蓝萼甲素A(Glaucocalyxin A，GLA)以及蓝萼甲素B(Glaucocalyxin B，GLB)在治疗神经退行性疾病中发挥着重要作用[36].GLA可以作为mTOR抑制剂，通过抑制Akt/mTOR自噬信号通路机制，提高脑组织内淀粉样β蛋白的清除率，同时通过抑制mTOR/p70S6K通路，抑制Tau蛋白磷酸化[37].对治疗AD具有巨大潜力.GLB预处理可诱导Akt/mTOR信号通路激活，从而对糖氧剥夺模型(OGD/R)诱导的PC12细胞损伤有明显的保护作用[38].

PAB作为一种二萜化合物亦可通过调节PI3K/Akt/mTOR信号通路、JNK信号通路、Beclin-1信号通路等触发细胞自噬发生，发挥其延缓衰老以及抗肿瘤功效.

综上所述，研究者推测微管蛋白结合剂PAB可能在通过触发细胞自噬治疗AD方面具有一定潜力.目前关于PAB方面研究主要集中于抗肿瘤活性，关于抗AD活性方面研究未见报道.因此，进一步研究其抗AD方面活性，有助于发现更多抗AD药物，为抗AD药物筛选提供更多理论依据.