谢美林，徐海清 ，李景明，查道喜，王学瑛，陈 洋，朱启法

（1.中国农业大学食品科学与营养工程学院，北京 100083；2.安徽皖南烟叶有限责任公司，安徽宣城 242000）

太子参是石竹科植物孩儿参Pseudostellaria heterophylla（Miq.） Pax ex Pax etHoffm.干燥后的块根，具有益气、健脾润肺之功效[1]。近30 年，太子参的年需求量表现出强劲的增长趋势，支撑其市场需求不断攀升的背后，是太子参较为稳定、温和的功能性。现有研究表明，太子参有抗肿瘤[2-3]、免疫调节[4-5]、降血糖[6-7]、抗氧化应激[8]、保护心肌[9]等保健功效。目前公认多糖是太子参中最主要的活性物质之一，然而有关太子参多糖的研究大多集中在粗多糖的功能活性评价上，缺乏前期的纯化工艺、理化性质研究基础，其功能、药理活性的物质基础和指标性成分不够明确[10-11]，这给太子参多糖资源的开发和利用带来了局限。

免疫系统是一个错综复杂又重要的生理体系，伴随着免疫系统的钝化和免疫应答的失衡，各种疾病接踵而至[12]，通过调节免疫来预防或治疗疾病已成为研究热点之一。已有研究表明太子参在免疫调节方面表现出潜力，陈耀金等[4]利用太子参胶囊粉灌胃小鼠，结果表明其对免疫功能低下小鼠的免疫力有增强效果；并且张炎达等[5]从太子参须获得的粗提物也表现出显著改善小鼠免疫功能。由于小鼠单核巨噬细胞白血病细胞（Raw 264.7）体外培养过程中也具备对抗原的较强吸附与吞噬能力，并释放相关的免疫调节因子，在一定程度上能够模拟体内巨噬细胞有关的免疫调节作用，是该类研究中常用的模型细胞[13]。因此，本研究提纯了太子参多糖，并测定了太子参多糖的分子量与组成以及初步表征其结构，以此基础利用Raw 264.7 细胞模型初探了太子参多糖对脂多糖（Lipopolysaccharide, LPS）损伤Raw264.7 巨噬细胞的保护作用，以期促进太子参资源的开发应用。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

太子参 安徽皖南烟叶公司太子参种植基地提供，采收年份为2019 年，经晒干后直接运回实验室，于-20 ℃保存留用；小鼠单核巨噬细胞系Raw 264.7中国科学院细胞库提供；DEAE Cellulose-52 北京拜尔迪生物技术有限公司；单糖标准品（葡萄糖、半乳糖、木糖、阿拉伯糖、岩藻糖、甘露糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、核糖、N-乙酰-氨基葡萄糖、N-乙酰-氨基半乳糖） 上海源叶生物科技有限公司；葡聚糖分子量标准品（1、3、12、70、126、287 kDa）、青霉素-链霉素双抗（100×）、噻唑蓝（3-（4,5-dimethylthiazol-2-yl）-2,5-diphenyltetrazolium bromide，MTT）、二甲基亚砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）北京索莱宝科技有限公司；脂多糖（lipopolysaccharide，LPS） Sigma 公司；DMEM 高糖培养基美国Gibco 公司；类胎牛血清 美国HyClone 公司。

紫外可见分光光度计 北京普析通用仪器有限责任公司；IR Tracer-10 傅里叶变换红外光谱仪 岛津企业管理（中国）有限公司；U3000 高效液相色谱仪赛默飞世尔科技公司；Agilent 1206 高效液相色谱仪 安捷伦科技有限公司；XSP-C204 光学显微镜CIC 公司；RT-6100 酶标仪 雷杜生命科学股份有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 太子参粗多糖的提取 参考Hu 等[14]的方法，并稍作修改：太子参破碎成粉，过40 目筛，以蒸馏水为溶剂，100 ℃水浴提取120 min（1:8，m/v），8000 r/min离心15 min，取上清液备用，残渣按照相同方法反复提取共3次，合并上清液。旋蒸浓缩、Sevag 法除蛋白后加入无水乙醇配成终浓度为80%的乙醇溶液，于4 ℃条件下沉淀过夜12 h，8000 r/min 离心5 min后，收集沉淀，冷冻干燥，得太子参粗多糖。

1.2.2 太子参粗多糖的纯化工艺优化 DEAE Cellulose-52 是一种弱碱性阴离子填料，当粗多糖溶液通过时，中性多糖可以流出，酸性多糖吸附在色谱物质中，从而实现对中性与酸性多糖的有效分离[15]。因此，本研究使用DEAE Cellulose-52 填料进行粗多糖的纯化，参考雷思敏等[16]的方法，并稍作修改：以DEAE Cellulose-52 为柱填料，Tris-HCl 缓冲液溶解粗多糖上样，上样粗多糖浓度为1 mg/mL，采用NaCl盐溶液进行洗脱，流速为2.0 mL/min，10 mL/tube 收集，苯酚-硫酸法跟踪检测洗脱液，绘制洗脱曲线。

1.2.2.1 pH 的选择 预实验测定了缓冲液环境为pH7.2～7.8 的洗脱效果，其中pH7.6 的效果较佳。在预实验结果的基础上，准确称取太子参粗多糖样品25.0 mg，分别溶于25 mL pH 7.4、7.6、7.8 的Tris-HCl 缓冲液中，0.45 μm 微孔滤膜过滤后缓慢上样，吸附15 min，用0～0.3 mol/L NaCl 的Tris-HCl 缓冲液洗脱。

1.2.2.2 洗脱盐浓度的选择 参考1.2.2.1 中步骤，参数加以修改：pH7.6 缓冲液条件下，分别含0～0.1（0、0.1）、0～0.3（0、0.1、0.2、0.3）、0～0.5（0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5）mol/L NaCl 的Tris-HCl 缓冲液梯度洗脱，浓度梯度为0.1 mol/L。

1.2.3 太子参多糖（PHP）的理化特征及结构表征

1.2.3.1 紫外光谱扫描 称取适量冷冻干燥后的PHP，用去离子水配制成100 μg/mL 的PHP 溶液，在25 ℃，波长190～400 nm 范围的紫外扫描仪中进行扫描。

1.2.3.2 红外光谱扫描 称取2 mg 冷冻干燥后的PHP，与100 mg 经120 ℃烘干4 h 的溴化钾研磨混合后压片，在4000～400 cm-1的范围进行红外光谱扫描[17]。

1.2.3.3 分子量检测 采用凝胶渗透色谱（Gel permeation chromatography，GPC）测定PHP 的分子量分布[18]。具体如下：色谱仪为Agilent 1206，选用Agilent PL aquageL-OH MIXED-M 色谱柱（7.5 mm×300 mm,8 μm），检测器为示差折光检测器，进样量为20 μL，流动相为0.1 mol/L NaNO3溶液，流速为1.0 mL/min，柱温为30 ℃。

1.2.3.4 单糖组成 采用1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮（1-phenyl-3-methyl-5-pyrazolone，PMP）柱前衍生化结合U3000 高效液相色谱（HPLC）法检测PHP 的单糖组成。参考戴军等的方法[19]，并稍作修改。PMP衍生：准确吸取250 μL 混合对照溶液到5 mL EP 管中，加入250 μL 0.6 mol/L NaOH，500 μL 0.4 mol/L PMP-甲醇，70 ℃反应1 h。冷水中冷却10 min；加入500 μL 0.3 mol/L HCl 中和，再加入1 mL 氯仿漩涡1 min，3000 r/min 离心10 min，小心取上清，萃取3次。上清用HPLC 进行检测。检测条件：色谱仪为赛默飞U3000，选用Xtimate C18色谱柱（4.6 mm×200 mm，5 μm），进样量为20 μL，流动相为0.05 mol/L的磷酸二氢钾溶液:乙腈（83:17），流速为1.0 mL/min，柱温30 ℃，检测波长为250 nm。

1.2.4 PHP 对Raw 264.7 巨噬细胞的保护作用

1.2.4.1 PHP 对Raw264.7 巨噬细胞的毒性作用浓度 细胞种板、培养参考Lee 等[20]的方法。取对数生长期细胞以1.0×105个/孔接种于96 孔培养板，每孔体积100 μL，37 ℃、5% CO2培养箱中培养12 h，待细胞贴壁后，弃去上清液，分别加入含80、160、320、640、960 μg/mL PHP 的饥饿培养基（含2% 胎牛血清）100 μL，空白对照组为相同体积的饥饿培养基，同一处理设置6 个平行复孔。24 h 后采用MTT法检测细胞存活率，用酶标仪检测各孔在492 nm 下的吸光值。

1.2.4.2 PHP 对LPS 诱导伤害的细胞存活率影响LPS 诱导的免疫损伤是研究免疫调节作用的常用模型。参考Jin 等[21]的方法，并稍作修改。取对数生长期细胞1.0×105个/孔接种于96 孔培养板，每孔体积100 μL，37 ℃、5% CO2培养箱中培养24 h，待细胞贴壁后，弃去上清液，分别加入含80、160、320、640 μg/mL PHP 的饥饿培养基100 μL，空白对照组和阳性对照组均加入相同体积饥饿培养基。处理4 h后，更换培养液，除空白对照组外均加入含1 μg/mL LPS 的饥饿培养基100 μL，继续培养20 h。同一处理设置6 个平行复孔，随后采用MTT 法检测各孔在492 nm 下的吸光值，计算细胞存活率，并采用光学显微镜对培养结束后的细胞形态进行观察。

式中：A2表示实验组的吸光值；A1表示对照组吸光值；A0表示空白组吸光值。

1.2.5 太子参多糖的测定 采用苯酚-硫酸法测定太子参多糖[22]。具体如下：准确称取无水葡萄糖10 mg，用蒸馏水定容至100 mL，摇匀后即得100 mg/L 的葡萄糖标准溶液。分别量取0.1、0.3、0.5、0.7、0.9、1.1、1.3 mL 于试管中，加蒸馏水定容至2 mL。先加入1 mL 5%苯酚，振荡摇匀后再加入5 mL 浓硫酸，振荡摇匀后于100 ℃沸水浴中先加热15 min，后冰浴5 min，于490 nm 波长处测定吸光度。以2 mL蒸馏水按同样显色操作为空白对照。分别以葡萄糖含量（μg）为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。太子参粗多糖得率及纯度计算公式如下：

式中：m 表示由标准曲线计算出的多糖质量，mg；M1表示提取时太子参粉的质量，mg；M2指太子参粗多糖的质量，mg；n 表示稀释倍数。

1.3 数据处理

测定结果采用平均值±标准差表示，数据采用SPSS Statistics 23 软件进行单因素方差分析，采用Excel、Origin 2017 软件作图。

2 结果与分析

2.1 太子参多糖的测定

由图1可知，葡萄糖标准曲线方程为y=0.0067x-0.0667，其R2=0.9987，表明在32～138 μg 的质量范围内具备良好的线性关系。通过水提醇沉法对太子参粗多糖进行提取，由苯酚-硫酸法检测得知太子参多糖得率为8.23%±0.78%，多糖纯度为51.47%±2.59%。与Hu 等的文献相比，多糖纯度提高了7.07%[14]。

图1 葡萄糖标准曲线Fig.1 Standard curve of glucose

2.2 太子参多糖的纯化工艺优化

2.2.1 pH 条件优化 DEAE Cellulose-52 是一种阴离子交换树脂，在碱性条件下有利于交换发生。基于此，本研究首先对比了太子参粗多糖在不同弱碱性（pH 为7.4、7.6、7.8）环境下的洗脱效果，以确定洗脱液的最佳pH。由图2可知，该粗提物中性多糖含量高，酸性多糖含量相对较低。并且不同pH 的洗脱液处理时，表现出不同分离效果；当pH 为7.4（图A）时，前半段分离效果比较好，而后三个峰存在连续拖尾现象；当pH 为7.6（图B）时，洗脱峰分离度高，无拖尾现象，主要峰的吸光值最高，洗脱效果较好；当pH 为7.8（图C）时，虽然峰形明显，但峰形不够尖锐。因此，选择pH 为7.6 作为太子参多糖纯化的pH 条件。

图2 不同pH 下的离子交换洗脱曲线Fig.2 Ion exchange elution curve at different pH

2.2.2 梯度洗脱盐浓度的选择 进一步对比了不同盐浓度（0～0.1、0～0.3、0～0.5 mol/L，NaCl）的洗脱液对太子参粗多糖的洗脱效果。由图3可知，在0～0.1 mol/L 的NaCl 条件下，峰分离度高，但峰数少，具有一定分离效果；在0～0.3 mol/L 的NaCl 条件下，多糖被主要分成5 个峰，其中前3 个分离度好，且吸光值高。在0～0.5 mol/L 的NaCl 条件下，多糖被分成更多级分，但分离度差，拖尾现象严重，不利于选择组分进行收集。因此本实验选择0～0.3 mol/L 的NaCl 作为太子参多糖纯化的盐浓度洗脱条件。

图3 不同洗脱盐浓度的离子交换洗脱曲线Fig.3 Ion exchange elution curve at different salt concentrations

综上，以pH7.6 的Tris-HCl 缓冲液上样，选择0～0.3 mol/L NaCl 的盐溶液进行洗脱，收集第1 个主峰，旋蒸浓缩，透析除盐，冷冻干燥，即得太子参多糖。采用苯酚-硫酸法检测其纯度为80.52%±1.84%，相比于现有文献，用于功能研究的太子参的多糖提取物，纯度提高了17.02%[23]。

2.3 PHP 的结构表征

2.3.1 紫外光谱扫描 如图4所示，曲线整体呈先上升再下降的趋势，在210 nm 左右有最大吸收，且吸光值高达2.000，而210 nm 为多糖的特征吸收峰[24]，此处吸光值高说明PHP 的主要成分为多糖。图中在240～290 nm 处有一个较宽的小吸收峰，吸光值低于0.500。260 和280 nm 分别是核酸和蛋白质的特征吸收波长[25]，这说明纯度为80.52%的PHP 的杂质主要可能为蛋白质和核酸。

图4 PHP 的紫外全扫描图谱Fig.4 UV spectra of PHP

2.3.2 红外光谱扫描 红外图谱常常用来鉴定多糖的初级结构。在中红外图谱解析中，一般将波数4000～1300 cm-1称为特征区，可以根据分子官能团和基团吸收峰来判断物质类别。1300～400 cm-1称为指纹区，可以判断糖苷键类型和构型[26]。

PHP 的红外扫描图谱见图5。图中3400 cm-1的-OH 伸缩振动峰、2936 cm-1的C-H 键的伸缩振动峰和1380 cm-1的C-H 键的弯曲振动峰，联合证明所检测化合物为糖类化合物[27-29]。在1636 和1424 cm-1分别为-COOH 的非对称及对称伸缩振动峰。图谱在1000～1200 cm-1的三个吸收峰是吡喃环吸收振动引起的，具有C-O-C 骨架[30]，α型的C-H在844 cm-1会有一个吸收峰，而β型的在891 cm-1处有一个吸收峰[31]，图中在852 cm-1有一个吸收峰，说明含有α-型糖苷键。综上说明PHP 是一种α-吡喃糖。

图5 PHP 的红外光谱扫描图Fig.5 Scanning infrared spectrum of PHP

2.3.3 分子量检测 多糖的溶解度和粘度受其分子量大小的影响，并且多糖链的大小与结构与其生物活性密切相关[30]。以出峰时间（t）为横坐标，分子量的对数值（lg Mw）为纵坐标，绘制标准曲线，得回归方程为lg Mw=-1.2807 t+15.374，R2=0.9981。

如图6所示，PHP 主要被分成3 个峰，其中2 个强吸收峰的出峰时间在9.38 与9.90 min，代入标准曲线计算分子量分别为2.3×103和500 Da。此外，8.13～9.10 min 有1 个较大连续峰，代入标曲后分子量在5.2×103～92×103Da 之间。结合文献，太子参中多糖的分子量基本在3×103～2.2×105Da 之间[14,32-33]。有研究报道，醇沉的乙醇终浓度不同，所得多糖的分子量会不同[34]，李松法等[35]采用不同浓度的乙醇分级醇沉了黄芪多糖，发现醇沉所得黄芪多糖的分子量随乙醇浓度的升高而降低。本研究中太子参多糖分子量在500～92×103Da 之间，与现有的太子参多糖的分子量存在差异，这可能是使用80%乙醇浓度醇沉导致的。

图6 PHP 的分子量分布Fig.6 Molecular weight distribution of PHP

2.3.4 单糖组成检测 标准单糖出峰时间及顺序见图7。图8 为PHP 的HPLC 色谱图，PHP 主要是由葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖、甘露糖和葡萄糖醛酸组成。郭守斌测定了10 种不同产地太子参的单糖，总结出太子参的单糖组成为半乳糖、D-甘露糖、鼠李糖、阿拉伯糖、D-无水葡萄糖、D-葡萄糖醛酸、D-半乳糖醛酸，且不同产地太子参多糖中单糖组成略有差异[36]，这与本实验结果是基本一致的。夏和先等比较了组培太子参和野生太子参的单糖组成，发现其单糖组成基本相同，但单糖的比例明显不同[37]。葡萄糖与半乳糖是PHP 中最主要的两种单糖，这与金针菇、杏鲍菇、猴头菇等食用菌多糖的单糖组成相类似[38]，可能具有与其类似的免疫调节、降血糖血脂、抗疲劳等生理活性[39]。

图7 单糖混标样品的HPLC 色谱图Fig.7 HPLC spectrum of the mixture of monosaccharides

图8 PHP 的HPLC 图谱Fig.8 HPLC spectrum of PHP

2.4 PHP 对Raw 264.7 巨噬细胞的保护作用

2.4.1 PHP 对Raw 264.7 巨噬细胞的毒性作用浓度PHP 对 Raw 264.7 巨噬细胞毒性作用结果如图9所示。PHP 在80～640 μg/mL 范围内，对Raw 264.7巨噬细胞的存活率具有提升作用，且呈现剂量-反应关系，在添加量为320 μg/mL 时，细胞存活率最大，为111.35%。但是当浓度达到960 μg/mL 后，PHP 对细胞表现出毒害作用，因此，选择PHP 浓度为80～640 μg/mL 进行下一步实验。张丽娟等[40]探究了太子参多糖对Raw 264.7巨噬细胞免疫调节作用的影响，结果表明太子参多糖的安全浓度为600 μg/mL，这与本文研究结果相近。研究表明多糖可以通过促进巨噬细胞的增殖，从而增强巨噬细胞的吞噬作用[41]。此外，铁皮石斛多糖、杏鲍菇等多糖的单糖组成均以葡萄糖、半乳糖、甘露糖为主[38,42]，与本研究中PHP的单糖组成较为一致，且此类多糖均表现出免疫调节活性[42-43]，进一步说明PHP 具备潜在的免疫调节活性。

图9 PHP 对Raw 264.7 巨噬细胞存活率的影响Fig.9 Effects of PHP on cell viability in Raw264.7 cells

2.4.2 PHP 对LPS 诱导免疫损伤的Raw 264.7 巨噬细胞存活的影响 PHP 对LPS 诱导的免疫损伤下细胞存活检测结果如图10所示。与空白组相比，在1 μg/mL 的LPS 的诱导损伤下，细胞相对存活率极显著降低（P＜0.01），说明本实验成功建立了免疫损伤模型。不同浓度的PHP 处理后，Raw 264.7 巨噬细胞存活率有一定提升效果；当剂量为640 μg/mL 时，细胞存活率极显著提高了7.21%（P＜0.01）。这表明太子参多糖对Raw 264.7 巨噬细胞的免疫损伤具有一定缓解作用。

图10 PHP 对LPS 诱导损伤的Raw264.7细胞存活率的影响Fig.10 Effects of PHP on cell viability in Raw264.7 cells induced by LPS

Raw 264.7 巨噬细胞最好的状态呈透亮的圆形，细胞吞噬抗原过多、培养环境恶劣都会促使该细胞呈现梭形、长梭形[44]。由图11可知，空白对照组的Raw 264.7 巨噬细胞呈椭圆或圆形。模型组在LPS 刺激下，细胞发生形态变化，呈菱形、梭形，细胞密度明显少于空白对照组。陈光勇[45]、郑胜眉[46]等显微镜下观察Raw 264.7 巨噬细胞时，LPS 处理组同样出现了数量降低、长梭状的细胞形变等。加入PHP 的处理组中，细胞形态出现明显改善，大多细胞呈标准圆形、类椭圆形、纺锤形等，这表明PHP 具有改善Raw 264.7 巨噬细胞形态的作用。

图11 PHP 对LPS 诱导损伤的Raw 264.7 巨噬细胞形态的影响Fig.11 Effects of PHP on cell morphology in Raw264.7 cells induced by LPS

3 结论

本实验通过水提醇沉法从太子参中提取了太子参粗多糖，得率为8.23%，纯度为51.47%。并采用DEAE Cellulose-52 离子交换柱法纯化得太子参多糖（PHP），其纯度为80.52%。PHP 是一种α-吡喃糖，分子量在500～92×103Da，主要由葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖、甘露糖及葡萄糖醛酸组成。以LPS诱导的Raw 264.7 小鼠巨噬细胞为模型，PHP 可以提高免疫损伤后的细胞存活率，改善细胞形态，说明了PHP 对由LPS 诱导损伤的Raw 264.7 巨噬细胞有保护作用，初步表明具备体外调节免疫的潜力。