陈红旭，苑丽葳，张竣雄，王文欣，刘佳乐，王春梅，孙靖辉，张成义，李 贺，陈建光,

（1.北华大学药学院，吉林吉林 132000；2.吉林市中心医院，吉林吉林 132000）

长期失眠对人体身心健康十分不利[1]。中药治疗失眠在古籍中多有记载[2-3]。以中药提取物及其活性成分为对象，研究其镇静催眠作用及相关机制，已成为研究热点[4]。五味子（Schisandra chinensis），始收录于《神农本草经》，被列为上品中药，具有极高的药用价值[5]。木脂素作为其主要活性成分之一，其抗疲劳、抗衰老、抗炎、保肝、镇咳等功效已被广泛研究[6-12]。本课题组前期研究表明，五味子木脂素具有显著的镇静、催眠及抗焦虑作用[13-15]。《中国药典》中规定五味子果实部位为入药部位[16]，并且可用作保健食品的原料。目前，在我国最为广泛使用的保健食品原料中，有9 种为传统中药，分别为五味子、酸枣仁、茯苓、灵芝、天麻、刺五加、珍珠、远志和百合[17]。其中，五味子在种植时，为了提高果实的产量和品质，藤茎作为非药用部位需要减掉30%～40%，其中一部分用作调料粉在餐桌上被使用，绝大多数则直接被丢弃[18]。研究表明，五味子藤茎的木脂素含量较果实偏低，但其化学成分与果实相似，提示五味子藤茎木脂素有可能具有与五味子果木脂素相似的功效[19]。目前，关于五味子藤茎木脂素镇静催眠作用的研究尚无任何报道。因此，本研究以课题组前期工作中五味子果木脂素的功效研究为基础，按照《中国药典》中规定五味子木脂素测定标志物醇甲含量为基准，设定五味子藤茎木脂素的给药剂量，观察其镇静、催眠及抗焦虑作用，以期为非药用部位资源的利用提供理论基础，为开发安全有效的镇静催眠药物提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

五味子藤茎总木脂素（Schisandra chinensisvine stem lignans，SSL） 经高效液相色谱法检测其五味子醇甲含量为0.14 mg/mL，北华大学五味子开发及产业化工程研究中心提供；羧甲基纤维素钠、戊巴比妥钠 北京化学试剂公司；地西泮（Diazepam，DAP）山东信谊制药有限公司；小鼠γ-氨基丁酸（γaminobutyric acid，GABA）ELISA 试剂盒、谷氨酸（glutamate，Glu）ELISA 试剂盒 上海酶联生物科技有限公司。清洁级ICR 小鼠 体重（20±2）g 雄性，动物许可证编号：SCXK（吉）-2020-0001，长春市亿斯实验动物技术有限责任公司提供。

ZZ-6 小鼠自主活动测试仪、PMT-100 高架十字迷宫、ZMT-100 高架零迷宫 成都泰盟科技有限公司；手持组织匀浆机 上海净信实业发展有限公司；全自动酶标仪 瑞士Tecan 集团。

1.2 实验方法

1.2.1 动物分组 实验流程严格遵守《实验动物的护理和使用指南》,并获得北华大学动物保护与使用委员会（IACUC）的批准。ICR 小鼠150 只，平均随机分组，每组30 只。因木脂素为脂溶性物质，故以5%的羧甲基纤维素钠水溶液作为溶媒将木脂素制成不同浓度的混悬液，将小鼠分为空白对照组（CON，5%羧甲基纤维素钠溶液灌胃）、藤茎木脂素低剂量组（SSL（L），37.5 mg/kg）、中剂量组（SSL（M），75 mg/kg）、高剂量组（SSL（H），150 mg/kg）、地西泮阳性对照组（地西泮，4 mg/kg）。分笼饲养，自由饮水、饮食，室温20～25 ℃。每天灌胃1次，每次0.1 mL/10 g，连续7 d。1～10 号小鼠于实验第5 d 进行小鼠自主活动检测，第6 d 进行高架十字迷宫及零迷宫检测，第7 d 进行戊巴比妥钠阈下剂量协同睡眠试验；11～20 号小鼠于实验第7 d 进行阈剂量协同睡眠试验；21～30 号小鼠于实验第7 d 麻醉处死小鼠后迅速取出脑组织，进行相关指标检测。

1.2.2 SSL 对小鼠自主活动的影响 小鼠于实验第5 d 灌胃40 min 后进行试验，记录小鼠5 min 内站立以及活动次数，每组实验结束后喷洒酒精除去气味后方可进行下一组实验。

1.2.3 SSL 对小鼠抗焦虑作用的影响 小鼠于实验第6 d 灌胃40 min 后进行试验。

1.2.3.1 SSL 对小鼠高架十字迷宫行为学的影响将小鼠从高架十字迷宫中心处面向开臂放入。计算小鼠5 min 内开臂与在臂滞留时间的比值（OT%）和开臂与在臂进入次数比值（OE%）。实验完成后喷洒适量酒精除去气味后再放入下一只小鼠。

1.2.3.2 SSL 对小鼠高架零迷宫行为学的影响 将小鼠从高架零迷宫面向闭合臂放入。计算小鼠在5 min内平台边缘探头次数百分率（OP%）、进入开臂的次数百分率（OE%）。实验结束后喷洒适量酒精除去气味后再放入下一只小鼠。

1.2.4 SSL 对戊巴比妥钠诱导小鼠睡眠的影响

1.2.4.1 阈下剂量戊巴比妥钠协同睡眠试验 于实验第7 d 灌胃给药40 min 后将1～10 号小鼠腹腔注射戊巴比妥钠37.5 mg/kg。记录30 min 内小鼠翻正反射消失60 s 的只数，即为30 min 内各组小鼠入睡的只数。

1.2.4.2 阈剂量戊巴比妥钠协同睡眠试验 于实验第7 天另取11～20 号小鼠，于灌胃给药40 min 后腹腔注射戊巴比妥钠49.5 mg/kg。计算小鼠的睡眠潜伏期（入睡时间-注射时间）和睡眠时长（睡醒时间-入睡时间）。

1.2.5 小鼠脑组织中GABA、Glu 含量测定 在末次给药40 min 后，将21～30 号小鼠断颈处死，于装满冰块的烧杯中快速取出大脑，用4 ℃生理盐水洗净并擦干后高速匀浆并分离上清液。（1:4 加入生理盐水，4 ℃，离心10 min），检测按照试剂盒说明书进行操作。

1.2.6 小鼠脑组织中GABAAα1受体表达水平检测使用Western Bolt 法检测，取小鼠脑组织约50 mg于1.5 mL EP 管中，加入（RIPA 裂解液:PMSF=9:1）的混合溶液450 μL，置于-20 ℃裂解1 h，4 ℃，12000 r/min 离心10 min 后取上清，蛋白含量使用BCA试剂盒测定。10% SDS-PAGE 电泳分离GABAAα1后转移到PVDF 膜上，取出膜在Tris 缓冲液中在摇床上漂洗5 min，然后用5%脱脂奶粉的TBS-T 缓冲液中摇床上封闭1 h。室温孵育后舍弃奶粉溶液。加入一抗（GABAAα1, 1:1000），内参为GAPDH（兔抗GAPDH, 1:5000），4 ℃过夜孵育，第二日用TBST 缓冲溶液清洗3次（每次10 min），加入二抗（1:2000）室温在摇床上孵育2 h, TBS-T 缓冲溶液清洗3次（每次10 min），最后加入ECL 发光液显色。

1.3 数据处理

数据以Mean±SD 表示，使用SPSS 软件（SPSS 20.0）进行数据分析。多组间比较采用单因素方差分析，两组间比较采用最小显著差异法t检验，P＜0.05即有统计学意义。Weastern Bolt 条带分析使用Image J 软件。

2 结果与分析

2.1 SSL 对小鼠自主活动的影响

小鼠自主活动实验是一种常用的药物镇静作用检测方法，其中的活动次数和站立次数是常用的评价指标，与小鼠中枢神经的兴奋程度成正相关[20-22]。结果如图1所示，与CON 组相比，SSL（M）、SSL（H）以及DAP 组小鼠活动次数显著减少（P＜0.05 或P＜0.01），SSL 各组及DAP 组小鼠站立次数极显著减少（P＜0.01），其中SSL 组间比较结果显示SSL（H）较SSL（L）组小鼠站立次数显著减少（P＜0.05）。以上结果提示SSL 具有镇静作用。

图1 SSL 对小鼠自主活动的影响（n=10，mean±SD）Fig.1 Effects of cane lignans from Schisandra chinensis on autonomous activities of mouse (n=10，mean±SD)

2.2 SSL 对小鼠抗焦虑作用的影响

2.2.1 SSL 对小鼠高架十字迷宫行为学的影响 高架十字迷宫实验是检测小鼠焦虑水平常用的实验方法[23]，开臂与在臂进入次数比值（OE%）及开臂与在臂滞留时间的比值（OT%）常作为评价焦虑程度的直接指标[24]。由图2可知，与CON 组比较，SSL（M）、SSL（H）及DAP 组小鼠OE%及OT%均极显著增加（P＜0.01），SSL 各给药组间比较无统计学差异（P＞0.01）。以上结果提示SSL 具有抗焦虑作用。

图2 SSL 对小鼠高架十字迷宫行为学的的影响（n=10，mean±SD）Fig.2 Effects of cane lignans from Schisandra chinensis on the behavior of anxious mouse with elevated plus maze（n=10，mean±SD）

2.2.2 SSL 对小鼠高架零迷宫行为学的影响 高架零迷宫实验也是检测动物焦虑水平常用的实验方法之一，与十字迷宫原理相同，常把OE%和开臂探头次数比例（OP%）作为评价指标[25]。本实验研究结果由图3可知，与CON 比较，SSL（M）、SSL（H）以及DAP 组小鼠OE%及OP%均显著增加（P＜0.05 或P＜0.01）。SSL 各给药组间比较无统计学差异（P＞0.01）。该结果进一步验证了高架十字迷宫的实验结果，提示SSL 具有抗焦虑作用。

图3 SSL 对小鼠高架零迷宫行为学的的影响（n=10，mean±SD）Fig.3 Effect of SSL on the behavior of elevated zero maze in mice (n=10, mean±SD)

2.3 SSL 对戊巴比妥钠对小鼠协同睡眠实验的影响

戊巴比妥钠协同睡眠试验是观察药物催眠作用的经典试验[26]。戊巴比妥钠阈下剂量协同睡眠实验结果如表1所示，空白对照组的睡眠只数为1 只，SSL（L）组睡眠只数为3 只，SSL（M）组睡眠只数为6 只，SSL（H）组的睡眠只数为7 只，DAP 组的睡眠只数为10 只。

表1 SSL 对阈下剂量戊巴比妥钠诱导小鼠睡眠只数的影响Table 1 Effects of cane lignans from fructus Schisandra chinensis on the sleep number of mouse induced by subthreshold dose of pentobarbital sodium

戊巴比妥钠阈剂量协同睡眠实验结果如图4所示，与CON 组相比，各SSL 组及DAP 组小鼠睡眠潜伏期均极显著缩短（P＜0.01），SSL 各给药组间比较结果显示，SSL（H）组较SSL（M）及SSL（L）组小鼠睡眠潜伏期显著缩短（P＜0.05 或P＜0.01）；与CON 组相比，各SSL 组及DAP 组小鼠睡眠时间均极显著缩短（P＜0.01），其中SSL（H）组较SSL（L）组小鼠睡眠睡眠时间极显著延长（P＜0.01）；各给药组间比较显示睡眠时间显著延长（P＜0.05）。以上结果提示SSL 具有催眠作用，且随着剂量的增加，催眠效应明显增强。

图4 SSL 对阈剂量戊巴比妥钠诱导小鼠睡眠时间的影响（n=10，mean±SD）Fig.4 Effects of Schisandra chinensis lignans on sleep time in mouse induced by threshold dose of pentobarbital sodium(n=10，mean±SD)

2.4 SSL 对小鼠脑组织中GABA、Glu 含量的影响

睡眠与中枢神经系统的众多神经网络及神经递质密切相关[27]。Glu 和GABA 是中枢神经系统（CNS）中的主要调节递质，GABA 是抑制性递质，由Glu 脱羧生成，主要通过与 GABAA受体结合，从而发挥作用，其在缺乏时会导致焦虑情绪的产生。Glu 是兴奋性递质，在CNS 含量较高。但是由于机体代谢水平以及环境的不停变化，少部分的Glu 才具有神经递质的功能，所以Glu 含量不能完全判断神经功能的兴奋或抑制状态[28]。能客观评价中枢神经系统功能兴奋和抑制程度的指标通常为GABA/Glu 的比值[29-30]。本研究应用酶联免疫吸附试验对各组小鼠脑组织GABA 和Glu 含量进行检测。结果如图5所示：与CON 组相比，SSL 各剂量给药组小鼠GABA 含量极显著升高（P＜0.01），SSL（M）及SSL（H）组小鼠Glu 含量极显著降低（P＜0.01)，SSL 各组GABA/Glu比值均极显著升高（P＜0.01）。对上述各指标SSL 不同给药剂量组组间比较结果显示，SSL（M）组较SSL（L），SSL（H）组较SSL（M）及SSL（L）均具有显著统计学差异（P＜0.01，P＜0.05）。以上结果提示SSL 能够增高小鼠脑组织GABA 含量，降低Glu 含量，升高GABA/Glu 的比值，且随着SSL 剂量的增加，该效应逐渐增强。该结果提示SSL 的催眠作用可能与其调节小鼠脑组织GABA/Glu 的比值有关，且该作用存在剂量效应关系。

图5 SSL 对小鼠脑组织中GABA、Glu 含量的影响（n=10，mean±SD）Fig.5 Effects of cane lignans from fructus Schisandra chinensis on the contents of GABA, Glu in brain tissues of mouse (n=10, mean±SD)

2.5 高剂量SSL 对小鼠脑组织中GABAAα1 蛋白表达的影响

作为GABAA受体重要亚型之一的GABAAα1，被激活时可抑制神经递质的兴奋作用，从而达到镇静、催眠作用[31-32]。为了进一步探讨SSL 对中枢神经镇静催眠等抑制作用的机制，本研究选择效应最明显的SSL（H）组小鼠，应用Western Blot 方法对GABAAα1表达水平进行观察。对本研究结果如图6 和表2所示，与CON 组比较，SSL 组小鼠脑组织GABAAα1蛋白表达水平极显著增加（P＜0.01）。本结果提示SSL的镇静催眠及抗焦虑作用可能与其上调小鼠脑组织GABAAα1水平有关。

图6 小鼠脑组织中GABAAα1 蛋白表达电泳Fig.6 GABAAα1 protein expression electrophoresis in mouse brain tissue

表2 小鼠脑组织GABAAα1 蛋白表达（n=3，mean±SD）Table 2 Expression of GABAAα1 protein in mouse brain tissue(n=3, mean±SD)

3 结论

本实验选用低、中、高三个剂量对SSL 的镇静催眠及抗焦虑作用进观察，研究结果显示，给予SSL 后，自主活动检测中小鼠的站立次数、活动次数均有所减少；高架十字迷宫及零迷宫的检测中小鼠OE%、OT%及OP%明显增加；戊巴比妥钠协同睡眠实验中小鼠睡眠只数增加，睡眠潜伏期明显减少并且睡眠时长明显增加，提示SSL 具有镇静催眠及抗焦虑作用。对小鼠脑组织中GABA 及Glu 含量及GABAAα1受体表达水平检测结果显示，SSL 能够明显提高GABA/Glu 的比值，增加GABAAα1表达水平，这可能是SSL 发挥镇静催眠抗焦虑作用的主要机制之一。本研究明确了SSL 对小鼠的镇静催眠及抗焦虑作用，为五味子非药用部位资源的利用提供理论基础，为开发安全有效的镇静催眠药物提供实验依据。