吴海涛，张艺玮

（1.黑龙江八一农垦大学理学院，黑龙江大庆 163319；2.黑龙江八一农垦大学食品学院，黑龙江大庆 163319）

多糖作为天然食品添加剂是安全的，被认为是改善产品品质的重要物质，此外，多糖化具有提升食品的营养价值，广泛应用于医学、食品等多个行业，对多糖加工特性的探究为其应用提供理论基础。近年来，蜂蜜多糖被人们渐渐关注。蜂蜜多糖是存在于蜂蜜中罕见的微量物质，又称作蜂蜜糊精，是蜂蜜的胶体成分，来源为花蜜和脂质[1]。有研究表明，蜂蜜含有低分子量多糖，可以抵抗宿主酶的降解，因此可作为肠道微生物菌群的营养来源[2-3]。总之，蜂蜜作为一种独特的天然产物具有重要的研究价值。

蜂蜜多糖种类随蜜源的不同而具备不同的特性。1965 年，Siddiqui 等[4]已对一些蜂蜜样品中多糖成分含量进行了检测，多糖组成中均含有葡萄糖、半乳糖、甘露糖、阿拉伯糖和木糖，其中个别蜂蜜多糖中存在鼠李糖和微量的糖醛酸。Tonks 等[5]按分子大小对麦卢卡蜂蜜进行分馏，结果表明30 kDa 离心过滤器保留的物质中存在多糖，并且与大多数免疫细胞因子刺激活性相关，但是没有进一步对其成分进行研究。Megherbi 等[6]对金合欢、山地多花和多花种蜂蜜进行了指纹图检测，发现痕量的多糖。王彤[7]采用水溶醇沉法得到多糖沉淀，通过脱蛋白、透析和冷冻干燥得到产率均在0.04%左右的10 种蜂蜜多糖，利用毛细管电泳-紫外检测方法测定单糖组成和含量，结果表明10 种蜂蜜多糖均含不同比例的果糖和葡萄糖，天然多花种蜂蜜多糖和枣花蜂蜜多糖含鼠李糖，天然枣花蜂蜜多糖和荞面花蜂蜜多糖含阿拉伯糖。关于多糖的热力学研究是其生物应用的一个重要内容，多糖的热稳定性可确定其在工业生产中质量的变化。流变特性是多糖作为增稠和稳定剂的必需研究指标，主要受温度、pH 及多糖浓度的影响，如角叉菜聚糖和卡拉胶在一定温度范围内的抗粘度能力使其成为食品或化妆品添加剂的理想备选材料[1]。对水和脂肪的结合能力是食品配方和加工中最实用的功能特性，多糖通过水和油的相互作用与食品的质地直接相关[8]，具有高持油性（oil holding capacity，OHC）的多糖能使高脂肪食品和乳液更加稳定。多糖的晶体特性与其物理、化学性能有直接的关系[9]。胶凝性质的探究为其在食品工业中胶凝剂和增稠剂的原料应用提供理论依据[10]；黑孜然种子多糖发泡性的探究为其用于食品配方中的发泡剂提供数据支撑[11]。综上，加工特性的探究是研究多糖特性的重要内容。然而，蜂蜜多糖作为一种新型多糖，其加工特性鲜有研究。亟需关于蜂蜜多糖的热力学、流变学方面的研究，从而促进蜂蜜多糖的开发利用。

蜂蜜多糖作为珍贵的功能性物质，其成分的探究及开发具有一定的研究价值。为了开发有价值的蜂蜜多糖，本实验选择椴树蜂蜜、多花种蜂蜜作为原材料进行蜂蜜多糖的制备及特性研究。采用热重和差示扫描量热分析进行热力学测试，采用静态和动态流变测试进行流变特性分析，测定蜂蜜多糖的持水性及持油性；以期为椴树蜂蜜、多花种蜂蜜在保健产品中的利用提供科学依据，促进新型多糖的开发及利用，并且推动蜂蜜整个产业的发展。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

椴树蜂蜜、多花种蜂蜜 购自黑龙江省哈尔滨市超市（天然原料蜜，保存在4 ℃）；其他试剂 均为国产分析纯。

HH-4J 数显恒温搅拌水浴锅 上海霓玥仪器有限公司；TDL-40B 高速大容量离心机 华威科创科技有限公司；Pilot10-15M 冷冻干燥机 北京博医康实验仪器有限公司；SDT 650 同步热分析仪、Discover-HR-1 旋转流变仪 美国TA 公司；RE-2000A 旋转蒸发仪 河南益源仪器有限公司；D8 ADVANCE 采用X-射线衍射仪 德国Bruker。

1.2 实验方法

1.2.1 蜂蜜多糖的制备 采用水溶醇沉法提取蜂蜜多糖[4,12]。100 g 蜂蜜加200 mL 蒸馏水于烧杯中，60 ℃溶解2 h，室温下加3 倍体积95%的乙醇提取14 h。离心（6000×g，10 min）收集沉淀物，然后将沉淀物溶解在水中。采用Sevag 法去除蛋白，采用过氧化氢法脱色。使用旋转蒸发仪进行浓缩。选择分子截留量为8～14 kDa 的透析袋透析48 h，每6 h 换水。收集透析液，离心，冻干得到蜂蜜多糖。多糖含量通过苯酚-硫酸法测定[13]，以葡萄糖标准品为参照，标准曲线方程为Y=6.99X+0.00733（R2=0.99656），其中X 为葡萄糖质量浓度（mg/mL），Y 为吸光值。根据标准曲线计算蜂蜜多糖中粗多糖含量。

1.2.2 X-射线衍射测定 采用X-射线衍射仪进行蜂蜜多糖晶体结构的分析。室温（20 °C）下，取微量样品（2 mg），衍射角度2θ=5°～60°，步长为0.1°，扫描速度为每0.1 s/步。

1.2.3 热力学特性分析 蜂蜜多糖的热力学特性采用热重-差热同步热分析仪进行分析，在升温、恒温或降温过程中，观察样品的质量随温度或时间的变化。将10 mg 样品放入铂坩埚中，使用空铝盘作为参考，在氮气保护下以10 ℃/min 的速率从25 ℃升温到700 ℃，得到热重（TG）和导数热重（DTG）；将仪器从室温加热到400 ℃进行DSC 分析测定，升温速率同上。

1.2.4 流变特性测定 取5 mg/mL 的蜂蜜多糖溶液，水浴（60 ℃）搅拌2 h 后，密封，静置过夜。使用旋转流变仪测定蜂蜜多糖溶液的流变特性。

选用Steady-State flow 模式，测试温度为25 ℃，测定多糖溶液在剪切速率为0.1～100 s-1条件下的表观粘度和应力。

选用Oscillation-Frequency 模式，测试温度为25 ℃，扫描频率为0.1～100 Hz，振荡应变固定为2%，研究多糖随振动频率变化的粘弹性质，得到储能模量、损耗模量及相位角tanδ。

流变仪设定温度扫描范围为20～90 ℃，升温速率为2 ℃/min，频率固定为1 Hz（6.28 rad/s），记录温度对多糖流变特性的影响。

1.2.5 持水性与持油性测定 蜂蜜多糖的持水量（Water holding capacity，WHC）和持油量（Oil holding capacity，OHC）根据Yuan 等报道的方法稍作改动进行测定[14]。

持水量的测定：将50 mg 蜂蜜多糖（精确到0.001 g）放入离心管中，称重，分散到5 mL 蒸馏水中。在室温下混匀，每15 min 振摇5 s，1 h 后将其离心（4000×g，20 min），除去上层水分，游离水的质量为m。WHC 表示为每克多糖所含的水克数，计算公式如下：

持油量的测定：将50 mg 蜂蜜多糖（精确到0.001 g）放入离心管中，称重，然后加入5 mL 大豆油。在室温下孵育60 min，每15 min 将悬浮液涡旋混合5 s。1 h 后将其离心（4000×g，20 min），除去上层相，将与多糖分离的油的质量测定为m0。OHC 表示为每克多糖中所含油的克数，计算公式如下：

1.3 数据处理

数据采用平均值±标准偏差的形式。使用SPSS 26.0 软件进行方差分析，使用Origin 9.65 绘图处理。所有试验至少重复三次。

2 结果与分析

2.1 X-射线衍射分析

多糖的晶体和半晶体结构直接影响其物理性质[15]。蜂蜜多糖的X-衍射记录见图1。

图1 蜂蜜多糖的X-射线衍射图Fig.1 X-ray diffraction spectrum of honey polysaccharides

如图1所示，两种蜂蜜多糖的X-射线衍射出现不明显的凸起，并无任何典型或尖锐的强烈峰，表明均为典型的无定形性质，MHP 分别在2θ=20°处有较弱的衍射峰出现，说明可能存在晶体结构，结晶度较小，与川贝母多糖的X-射线衍射分析相似[16]，而LHP 的X-衍射峰较MHP 更弱。X-衍射表明蜂蜜多糖既有结晶性又有无定形状态。

2.2 热力学特性

2.2.1 热重分析 多糖的热稳定性是多糖应用的重要特征，通过热重分析（TG）、导数热重分析（DTG）和示差扫描量热（DSC）分析蜂蜜多糖的热力学性质。TG 可测量温度变化过程中产品的重量损失和热降解温度[17]，见图2。如图2所示，蜂蜜多糖的热分解分成两个阶段，第一阶段为水分的流失，第二阶段为蜂蜜多糖的化学分解。兰茎粉多糖[18]和绿豆皮多糖[19]等天然多糖也有两个热分解阶段。通过分析可知，LHP 和MHP 的重量损失分别为85.05%和81.30%，热降解温度分别为236.7 和322 ℃。LHP 失重比MHP 多，MHP 具有更强的热稳定性和更稳定的结构，这种热稳定性的差异可能是由多糖的结构、分子量大小引起的[20]。

图2 蜂蜜多糖的TG、DTG 曲线图Fig.2 TG and DTG curve of honey polysaccharides

2.2.2 示差扫描量热分析 DSC 用于确定蜂蜜多糖随着温度升高而发生的吸热或放热变化[21]，见图3。如图3所示，LHP 和MHP 均表现出一个较宽的放热反应峰，分别在75 和72 ℃附近，该范围蜂蜜多糖为失重状态，可能发生分解反应，而在400 ℃后可能存在特征峰-吸热峰。川贝母多糖的DSC 分析在231.9 和300.1 °C 出现放热谷，多糖热稳定性的差异可能是由提取方法、多糖的化学组成和结构之间的差异引起[22]。总体来看，LHP 和MHP 的热稳定性较强，可在正常操作温度下保持稳定。

图3 蜂蜜多糖的DSC 曲线图Fig.3 DSC curve of honey polysaccharides

2.3 流变特性

2.3.1 静态流变学测试 如图4所示，显示了蜂蜜多糖溶液（0.5%）的稳态剪切流动曲线。图4 中两种蜂蜜多糖溶液均表现出剪切变稀行为。随剪切速率的增大，表观粘度逐渐降低，符合非牛顿流体特征，即为剪切稀化的假塑性流体，此现象与黑穗醋栗多糖的流变特性相同[23]。剪切变稀的主要原因是分子在流动方向的取向、柔性链的变形和分子间相互作用的减少[24-25]。LHP 和MHP 在高剪切速率下粘度分别在1.3 和1.2 mPa·s 保持不变，LHP 的分子量大，阻力大，进而粘度相对较大，而粘度较低的多糖，意味着可以在较低的能量下运行，能够减少机械运转过程中的能损耗，利于工业化生产[26]。

图4 蜂蜜多糖随剪切速率的流变学变化Fig.4 Rheological changes of honey polysaccharides with shear rate

2.3.2 动态流变学测试 0.5%的LHP 和MHP 的频率扫描变化见图5。储能模量（G'）反映了蜂蜜多糖溶液的弹性性质，损耗模量（G″）反映了蜂蜜多糖溶液的粘性性质[27]。如图5所示，LHP 和MHP 在频率为0.1～100 Hz 内G″＜G'，且两条曲线接近于平行变化，表现为弱凝胶行为，刺梨多糖也得到了类似的结果[28]。

图5 蜂蜜多糖的流变特性随频率的变化Fig.5 Changes of rheological properties of honey polysaccharides with frequency

蜂蜜多糖溶液（0.5%）从20 ℃升温到90 ℃的粘度和应力变化见图6，如图6a所示，两种蜂蜜多糖溶液的粘度在温度20～63 ℃范围内几乎没有变化，并在很宽的温度范围内保持稳定（见图6b）。绿藻胞外多糖也得到了类似的结果[7]。结果表明，在一般温度范围内，LHP 和MHP 的粘度不受影响，是食品或化妆品添加剂的理想选择。

图6 蜂蜜多糖随温度影响的流变变化图Fig.6 Rheological changes of honey polysaccharides with temperature

2.4 持水性与持油性

保水和结合脂肪的能力是食品配制和加工中最实用的功能特征，通过水和油之间的相互作用直接与产品质地相关[2]。结果如表1所示，LHP 和MHP 的持水量分别为(1.60±0.09) g 水/g 和(0.40±0.02) g 水/g，低于杏仁多糖1.95 g 水/g[28]。LHP 和MHP 的持油量分别为(18.80±1.05) g 油/g 和(11.4±0.89) g 油/g，高于绿藻酸性多糖的持油量（15.09 g 油/g）[15]，高OHC的多糖对高脂食品和乳液的稳定性能更强。蜂蜜多糖具有理想的脂肪结合力，因此，蜂蜜多糖在功能性食品工业中具备潜在的应用基础。蜂蜜多糖作为水溶性多糖，其表现出的持水持油特性是多糖与其所合有的蛋白质共同作用的结果，即蛋白质作为疏水结构存在，而多糖链作为亲水性结构存在。

表1 蜂蜜多糖的持水性和持油性Table 1 Water holding capacity and oil holding capacity of honey polysaccharides

3 结论

本文利用X 射线衍射研究椴树蜂蜜多糖和多花种蜂蜜多糖的晶体结构，也通过热力学特性、流变学特性、持水性和持油性来研究其加工特性。结果表明，MHP 具有更好的热稳定性；两种多糖溶液在高频率剪切下表现为弱凝胶行为；剪切速率变化下，表现为剪切稀化行为；且温度对蜂蜜多糖的流变特性不具有很大程度的影响。根据流体力学，多糖加热后，分子无规则运动增加，分子间距增大，减弱了多糖分子链之间的相互作用，多糖链更易于运动，溶液粘度降低，剪切稀化现象明显。根据本文结果，可以利用蜂蜜多糖热重分析，对不同温度下的蜂蜜多糖开发利用。同时，蜂蜜多糖具有较好的水和脂肪结合能力。多糖加工特性的研究应从热力学特性和流变学特性等方面结合物理加工特性进行全面研究，进而为其在工业和功能性食品中的应用打下基础。