李 俊，蔡 滔，代虹镜，苏美丞，祝 愿，王 震,

（1.贵州省农产品质量安全监督检验测试中心，农业部农产品质量安全风险评估实验室，贵州贵阳 550004；2.黔南民族师范学院化学化工学院，贵州都匀 558000）

茶叶是我国重要的农产品之一，具有几千年的生产历史。茶叶生产和销售拉动了内需消费，促进了经济的可持续发展[1]。农药在茶树生产中具有防治病虫害、提升产量和改善产品品质等重要作用[2-5]，同时茶叶中农药残留问题成为茶叶质量安全关注的焦点之一[6]。为了保证茶叶质量安全，灵敏、准确的农药残留检测技术必不可少[7-8]。2021 年9 月实施的《食品安全国家标准 食品中农药最大残留限量》[9]规定了茶叶中农药最大残留限量有106 项限量要求，存在一个农药规定了几种检测方法的现象，比如哒螨灵、氯菊酯、氯唑磷等农药可采用GB/T 23200.113 或GB/T 23204-2008 方法检测。

在检验检测工作中，取样的代表性、溶液的配制以及样品处理过程等方面，都会导致检测结果产生一定的不确定性，对检测结果不能肯定的程度即为不确定度。不同方法引入的不确定度因方法差异而不同，为保证检测结果的准确度和可信性，有必要采用适当的检测方法，并对其测量不确定度进行合理评定[10-12]。测量不确定度是与测量结果相联系的参数，代表检测值的可信区间，是衡量实验室检测质量的重要指标，是实验室提高检验结果可靠性的重要保障[13-16]；当不确定度越小，检测结果可信度越高；反之越低。通过不确定度来源分析和分量评定，掌握影响检测质量的关键步骤，从而可提高检测实验室的数据质量[17-21]。

本研究分别采用国家标准《茶叶中519 种农药及相关化学品残留量的测定 气相色谱-质谱法》[22]和《植物源性食品中208 种农药及其代谢物残留量的测定 气相色谱-质谱联用法》[23]方法定量检测茶叶中哒螨灵等9 种农药残留量，依据《测量不确定度评定与表示》[24]和《化学分析测量不确定度评定》[25]，分析评定两个不同检测方法检测过程中各不确定度分量的来源，给出扩展不确定度，以期为农药残留检测实验室评定不确定度提供参考范例，为实验室选择更适应的检测方法，为检测结果的合理判定提供科学依据[26-27]。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

乙腈、甲苯 色谱纯，美国天地；氯化钠、正己烷、乙酸乙酯 分析纯，国药集团；PSA 吸附剂、C18 吸附剂、GCB 粉末 色谱纯，美国安捷伦；固相萃取柱Cleanert TPT 10 mL 2.0 g Agela 公司；9 种农药标准品：哒螨灵（pyridaben）、氟氯氰菊酯（Cyfluthrin）、甲拌磷（phorate）、甲基对硫磷（parathionmethy）、氯菊酯（Permethrin）、氯氰菊酯（Cypermethrin）、氯唑磷（isazofos）、氰戊菊酯（fenvalerate）、水胺硫磷（isocarbophos） 浓度均为1000 mg/L，农业部环境质量安全监督检验测试中心（天津）。

GC-MS/MS 联用仪Trace GC Ultra-TSQ MS/MS美国赛黙飞世尔公司；IKA T18 高速匀浆机 德国IKA 公司；IKA VRTEX2 涡旋混合器 德国IKA公司；BUCHI R-200 旋转蒸发仪 瑞士BUCHI 实验仪器公司；Organomation N-EVAP 美国OI 分析仪器公司；TSL-5-A 离心机 上海安亭科学仪器。

1.2 实验方法

1.2.1 标准品的配制

1.2.1.1 单标标准储备液的配制 准确吸取9 种农药标准和内标溶液各1.0 mL 于10 mL 容量瓶中，用丙酮溶液稀释到刻度，得到100.0 mg /L 标准单标储备液。

1.2.1.2 混合标准储备液的配制 准确吸取适量的100.0 mg/L 单标储备液于50 mL 容量瓶中，用丙酮稀释配制成2～4 mg/L 混合标准储备液。内标物配制为10 mg/L 的标准储备液。

1.2.1.3 基质匹配混合标准工作溶液配制 取不含待测物的茶叶样品，按相应的前处理方法制得空白基质溶液，准确吸取适量的混合标准储备液和1 mL 内标于10 mL 容量瓶中，用空白基质溶液定容配制成所需的标准工作液。混合标准工作溶液系列配制见表1。

表1 混合标准系列溶液Table 1 Preparation of mixed standard series solution

1.2.2 样品前处理

1.2.2.1 方法选择 分别参照方法1：GB 23200.113-2018《食品安全国家标准 植物源性食品中208 种农药及其代谢物残留量的测定气相色谱-质谱联用法》QuEChERS 部分；方法2：GB/T 23204-2008 《茶叶中519 种农药及相关化学品残留量的测定气相色谱-质谱法》进行样品前处理。供试茶样购置于市场，茶叶样品粉碎后过60 目筛，待分析。

1.2.2.2 样品提取 方法1：准确称取2 g 试样（精确至0.01 g）于50 mL 塑料离心管中，加10 mL 水涡旋均匀，静置30 min。加入15 mL 乙腈-醋酸溶液、6 g无水硫酸镁、1.5 g 醋酸钠及1 颗陶瓷均质子，剧烈振荡提取1 min，4200 r/min 离心5 min，吸取8 mL上清液，待净化。

方法2 ：准确称取5 g 试样（精确至0.01 g），于80 mL 离心管中，加入15 mL 乙腈，15000 r/min 均质提取1 min，4200 r/min 离心5 min，取上清液于200 mL鸡心瓶中。残渣用15 mL 乙腈重复提取一次，离心，合并二次提取液，40 ℃水浴旋转蒸发至1 mL 左右，待净化。

1.2.2.3 样品净化 方法1：吸取8 mL 上清液加到内含1200 mg 硫酸镁、400 mg PSA，400 mg C18及200 mg GCB 的15 mL 塑料离心管中，涡旋混匀1 min。4200 r/min 离心5 min，准确吸取2 mL 上清液于10 mL 试管中，40 ℃水浴中氮气吹至近干。加入100 μL的内标溶液，加入1 mL 乙酸乙酯复溶，过微孔滤膜，待气相色谱质谱测定。

方法2：用10 mL 的v（乙腈）:v（甲苯）=3:1 混合洗液预洗Cleanert TPT 固相萃取柱（柱中加入约2 cm高无水硫酸钠），加入待净化样品浓缩液转移至固相萃取柱中，用2 mL 混合洗液洗涤样液瓶，重复三次，并将洗涤液移人柱中，再用25 mL 乙腈-甲苯洗涤小柱，收集上述所有流出液于鸡心瓶中，40 ℃水浴中旋转浓缩至约0.5 mL。加入5 mL 正己烷进行溶剂交换，重复两次，最后使样液体积约为1 mL，加入100 μL 内标溶液，过微孔滤膜，待气相色谱质谱测定。

1.2.3 仪器条件

1.2.3.1 气相色谱条件 方法1：色谱柱：DB-1701MS石英毛细管柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；程序升温条件为；程序升温：初温40 ℃，以40 ℃/min 升温至120 ℃，再以5 ℃/min 升温至240 ℃，再以12 ℃/min 升温至300 ℃，保持6 min；载气为He，流速1.0 mL/min；进样口温度（280.0 ℃）；进样量1.0 μL；不分流进样。方法2：色谱柱：DB-1701MS 石英毛细管柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；程序升温条件为；程序升温：初温40 ℃，以30 ℃/min 升温至130 ℃，再以5 ℃/min 升温至250 ℃，再以10 ℃/min 升温至300 ℃，保持5 min；载气为He，流速1.0 mL/min；进样口温度（290.0 ℃）；进样量1.0 μL；不分流进样。

1.2.3.2 质谱条件 方法1：电子轰击（EI）离子源；电子能量70 eV；气相色谱-质谱传输线温度280 ℃；离子源温度280 ℃；多反应监测（MRM）模式扫描，碰撞反应气压力（Ar，2×10-4kPa）；溶剂延迟3 min。

方法2：电子轰击（EI）离子源；电子能量70 eV；气相色谱-质谱传输线温度280 ℃；离子源温度230 ℃；选择性离子监测（SIM）模式扫描；溶剂延迟5 min。

1.3 不确定度分析

1.3.1 数学模型的建立 根据GB/T 23200.113-2018和GB/T 23204-2008 方法（表2），茶叶中被测农药残留含量（w）按式（1）计算：

表2 GB/T 23200.113-2018 与GB/T 23204-2008 标准比较Table 2 Comparison Table of GB/T 23200.113-2018 and GB/T 23204-2008 standards

式中：w：茶叶中被测农药残留含量（mg/kg）；c：由标准曲线计算出测试样液的浓度（mg/L）；v：样液定容体积（mL）；m：样品称样量（g）；f：稀释因子（GB/T 23200.113-2018 为 7.5、GB/T 23204-2008为1.0）。

1.3.2 不确定度来源分析 按规范方法抽样和制备样品样品均匀性引入的不确定度忽略不计[26]。从数学模型和测定过程可知，不确定度分量包括以下几个方面：标准物质及其配制过程中引入的不确定度cs；内标物质使用引入的不确定度csi；样品称量引入的不确定度m；前处理过程中液体体积量取引入的不确定度v；标准工作液测量不确定度（Rrec）；样品溶液液中被测组分与内标峰面积比（Ai/Asi）；检测回收率（Qrec）等方面；不确定度分量来源见图1。

图1 测量不确定度分量鱼骨图Fig.1 Fishbone diagram of measurement uncertainty component

1.4 数据处理

通过Excel2010 与SPSS22.0 进行数据统计分析。

2 结果与分析

2.1 标准溶液配制引入不确定度urel（c）

实验室通常选择购买100 或1000 mg/L 的有证标准物质。通过配制成农药单标储备液、混合标准储备液、混合标准工作溶液、混合标准工作测试液。每一步都会有不确定度的带入，分析不确定带入因子详见表3。

表3 标准溶液配制引入不确定度Table 3 Introduction uncertainty of standard solution configuration

2.1.1 标准物质纯度引入不确定度urel（c1） 本研究中哒螨灵、氟氯氰菊酯、甲拌磷等9 个标准品的质量浓度均为1000 mg/L，其扩展不确定度[u95（c1）]为7 mg/L，包含因子（k）为2，则由标准品纯度引入的相对不确定度urel（cs-1）为：

某品牌标准品生产厂家生产标准品质量浓度均为1000 mg/L 时，其扩展不确定度[u95（c1）]为20 mg/L，其引入的相对不确定度urel（c1）为1.41%。

2.1.2 标准储备液配制引入不确定度urel（c2） 实验室储备液的配制包括单一标准储备液和混合标准储备液。先用1 mL A 级吸量管移取1.0 mL 1000 mg/L的标准溶液于10 mL 容量瓶中，用丙酮定容并配成100 mg/L 的单一标准储备液。然后再分别吸取1 mL单一标准储备液于50 mL 容量瓶中，用丙酮定容并配成2 mg/L 的混合标准储备溶液。过程中涉及温度变化对试剂膨胀的影响、人员量取误差及吸量管、容量瓶引入的不确定度。

丙酮膨胀引入分量，实验室温度通常为（20±5）℃，丙酮的膨胀系数为0.00143 ℃-1，由温度效应产生的丙酮体积变化为：u（v丙酮）=±（0.00143 mL×5×v）=±0.00715×v mL，服从矩形分布，则温度对丙酮体积变化的不确定度[urel（v丙酮）]为：

利用式（3）计算出标准储备液配制中，丙酮膨胀引入的不确定度[urel（v丙酮）]，为0.41%，引入4次。

人员吸量管使用量取误差引入分量，采用统计方法评定不确定度，通过在重现性、重复性条件下使用同一吸量管，重复量取纯水，利用电子天平测量，得到n=9次测量值（x），标准偏差s（x）利用贝塞尔式（4）计算，不确定度urel（x）按式（5）计算。

利用式（5）计算出标准储备液配制中，使用1 mL的A 级吸量管移取1.0 mL 样液时引入的人员测量不确定度[urel（s1）]，为0.13%，对于每一个组分引入2次。

量具允许误差引入分量：A 级1 mL 吸量管允许误差为±0.008 mL[27]，满足三角形分布，则由吸量管量取1.0 mL 溶液引入的不确定度[urel（v1）]为:

利用式（6）计算出标准储备液配制中，使用1 mL的A 级吸量管移取1.0 mL 样液引入的不确定度[urel（v1）]，为0.33%，对于每一个组分引入2次。

A 级10、50 mL 容量瓶的允许误差分别为±0.02 和±0.05 mL，读数重复性偏差分别为±0.01和±0.025 mL，均服从三角形分布。利用（6）式计算，则由10 mL 容量瓶允许误差带来的不确定度[urel（v2）]为0.082 %和读数误差带来的不确定度[urel（v3）]为0.041%；由25 mL 容量瓶允许误差带来的不确定度[urel（v4）]为0.041%和读数误差带来的不确定度[urel（v5）]为0.020 %。

利用式（7）计算可得由标准储备液配制带来的不确定度[urel（c2）]为0.97%。

2.1.3 混合标准工作液配制引入不确定度urel（c3）

混合标准工作液是通过使用混合标准储配液稀释，本实验中的混合标准工作液按表1 中浓度配制，分别吸取混合标准储备液于10 mL 容量瓶内，加入1 mL内标溶液，丙酮定容得到所需标准工作液。过程中涉及温度变化对试剂膨胀的影响、人员量取误差及吸量管、容量瓶引入的不确定度。标液和样液中内标物是采用同一瓶内标物质添加，故不考虑内标物质在配制过程中的不确定度的引入，仅考虑内标物添加时，体积引入的那部分不确定度。

丙酮膨胀引入分量，利用式（3）计算出标准工作溶液配制中，丙酮膨胀引入引入的不确定度[urel（v丙酮）]为0.41%，对每一个浓度点引入3次（标液量取、内标量取、容量瓶定容）。

人员吸量管使用量取误差引入分量，利用式（5）计算出标准工作溶液配制中，使用1 mL 的A 级吸量管移取0.5 mL 混合储备液配制浓度点1 时引入的人员测量不确定度[urel（s1）]为0.14%。浓度点2时引入的人员测量不确定度[urel（s2）]为0.13%。浓度点3 时引入的人员测量不确定度[urel（s3）]为0.26%。浓度点4 时引入的人员测量不确定度[urel（s4）]为0.59%。浓度点5 时引入的人员测量不确定度[urel（s5）]为0.50%。浓度点6 时引入的人员测量不确定度[urel（s6）]为0.49%。浓度点7 时引入的人员测量不确定度[urel（s7）]为0.76%。使用1 mL 的A 级吸量管移取1.0 mL 内标溶液时引入的人员测量不确定度[urel（si）]为0.13%。

量具允许误差引入分量，A 级1、2、5、10 mL 吸量管，A 级10 mL 容量瓶允许误差与读数重复性偏差引入不确定度。

A 级1、2、5、10 mL 吸量管，A 级10 mL 容量瓶的允许误差分别为±0.008、±0.012、±0.025、±0.050、±0.02、读数重复性偏差分别为±0.004、±0.006、±0.01、±0.025、±0.01mL。利用式（6）计算，浓度点1 使用A 级1 mL 吸量管吸取0.5 mL 混合标液和1 mL 内标物，引入的不确定度[urel（v1）]：

A 级1 mL 吸量管允许误差带来的不确定度[[urel（v1-1）]为0.653%和读数误差带来的不确定度[urel（v1-2）]为0.327%；10 mL 容量瓶带来的不确定度[[urel（v1-3）]为0.082%和读数误差带来的不确定度[urel（v1-4）]为0.041%；内标物对每个浓度点不确定度均为A 级1 mLA 级1 mL 吸量管允许误差带来的不确定度[[urel（v1-5）]为0.327%和读数误差带来的不确定度[urel（v1-6）]为0.163%。按式（8）计算，浓度点1 引入的不确定度[urel（v1）]为0.822%。

利用式（8），计算其他浓度点不确定度[urel（v2）]为0.525、[urel（v3）]为0.466%、[urel（v4）]为0.525%、[urel（v5）]为0.450%、[urel（v6）]为0.436%、[urel（v7）]为0.473%。

混合标准工作液每个浓度点引入不确定度[urel（c3-x）]，利用式（9）计算出混合标准工作溶液浓度点1[urel（c3-1）]不确定度为1.15%。

利用式（9），计算其他浓度点不确定度[urel（c3-2）]为0.902%，[urel（c3-3）]为0.898%，[urel（c3-4）]为1.07%，[urel（c3-5）]为0.987%，[urel（c3-6）]为0.975%。

利用式（10），计算可得由混合标准工作液配制带来的不确定度[urel（c3）]为2.21%。

综上，在标准品配制中，单标储备液、混合标准储备液、混合标准工作液配制引起的合成不确定度[urel（c）]为：

利用式（11），计算可得标准溶液配制步骤带来的不确定度[urel（c）]为2.46 %。

2.2 样品前处理引入不确定度urel（P）

2.2.1 样品质量称取引入的相对标准不确定度urel（m）

由天平允许误差不确定度urel（m1）、天平示值误差不确定度urel（m2）、称量重复性不确定度urel（m3）引入。

方法1，采用百分之一天平称取2 g 样品，天平的允许误差为0.01g、示值误差为0.005 g，符合矩形分布，则天平允许误差不确定度urel（m1）、天平示值误差不确定度urel（m2）分别为：

称样重复性（n=9）,用标准偏差S（x）利用贝塞尔公式（4）计算，不确定度urel（m3）按公式（5）计算为1.07%。

利用式（14），计算可得方法1 由称样带来的不确定度[urel（m）]为1.16 %，方法2 由称样带来的不确定度[urel（m）]为1.10%。

2.2.2 样品提取引入的相对标准不确定度urel（v1）

样品在提取、分取步骤过程中，方法1 仅考虑样品提取引入的相对标准不确定度urel（v1），由乙腈膨胀引入不确定度urel（v1-1）、吸量管引入不确定度urel（v1-2）、量取重复性引入不确定度urel（v1-3），吸取8 mL 上清液待净化，体积不直接带入不确定度，故不考虑不确定度引入。方法2 中提取液全部转入鸡心瓶40 ℃水浴旋转蒸发至1 mL 左右，待净化，无分取步骤，不考虑该步骤的不确定度引入。但无水硫酸镁、醋酸钠等试剂的多少、提取时间、均值转速等因素带入的不确定度均体现在样品的加标回收上，在后文回收率分量进行评定。

提取步骤是用A 级25 mL 吸量管量取15 mL乙腈试剂。乙腈膨胀引入分量，实验室温度通常为（20±5）℃，乙腈的膨胀系数为0.00137 ℃-1，由温度变化引起试剂膨胀带来的不确定度服从矩形分布，不确定度[urel(v1-1）]为0.395。A 级25 mL 吸量管最大允许误差±0.1 mL，读数重复性偏差为±0.05 mL，量器量取偏差服从三角形分布，故25 mL 吸量管量取15 mL 乙腈，允许误差和读数重复性引起的不确定度分别为[urel（v1-2）]为0.272%、[urel（v1-3）]为0.136%。

利用式（15），计算可得方法1 由提取步骤带来的不确定度[urel（v1）]为0.499%。

2.2.3 样品净化、定容引入的相对标准不确定度urel（v2） 样品净化、定容步骤过程中，两个方法的净化过程，方法1 中各填料的称取量、振动的频率和时间、离心的转速和时间、样品定容等均不直接带入不确定度，仅与量取2 mL 净化后样液和内标溶液的量取引入的相对标准不确定度[urel（v2）]；方法2 中洗液的量取、洗脱的速度、样品定容等均不直接带入不确定度，仅与内标溶液的量取有关；

净化步骤，方法1 用A 级2 mL 吸量管分取2 mL净化后样液，再用100 μL 单通道移液器量取100 μL内标，约用1 mL 乙酸乙酯复溶，待测。

乙腈试剂膨胀引起的相对不确定度[urel（v2-1）]为0.395%，A 级2 mL 吸量管最大误差为±0.012 mL，其相对不确定度[urel（v2-2）]为0.245%，读数重复性偏差为土0.006 mL，其相对不确定度[urel（v2-3）]为0.122%。

丙酮试剂膨胀引起的相对不确定度[urel（v2-4）]为0.41%，A 型100 μL 单通道移液器最大误差为±0.8 μL，其相对不确定度[urel（v2-5）]为0.327%。

利用式（16），计算可得方法1 由净化步骤带来的不确定度[urel（v2）]为0.711%，方法2 由净化步骤带来的不确定度[urel（v2）]为0.327%。

综上，在样品前处理中，提取液量取、分取、定容、内标量取引起的合成不确定度[urel（P）]为：

利用式（17），计算可得方法1 由样品前处理步骤带来的不确定度[urel（P）]为1.45 %，方法2 由样品前处理步骤带来的不确定度[urel（P）]为1.15%。

2.3 标准曲线拟合引入不确定度urel（R）

按1.2.3 配制好混合标准工作溶液，气质联用仪检测，每个浓度点测量5次，标准溶液化合物与内标物浓度比与标准溶液化合物与内标物峰面积比数据见表4。利用SPSS20.0 软件对表中数据作最小二乘法线性回归处理。拟合曲线和确定系数见表5。

表4 农药标准曲线测量结果Table 4 Measurement results of pesticide standard curve

利用式（18）计算出标准拟合曲线标准偏差SA，yi为第i次测量的溶液化合物与内标物峰面积比；a 为截距；b 为斜率；xi为第i次测量的标准溶液化合物与内标物浓度比；n 为标准溶液的测定总次数（n=30）。线性关系及拟合曲线的确定系数见表5。

利用式（19）计算拟合曲线引入的不确定度U（R）。SA为准曲线的标准差；p 为样品的测定次数（p=10）；n 为标准溶液的测定总次数（n=30）；b 为标准曲线的斜率为由标准曲线求得的样品溶液浓度平均值（见表5）；为各标准系列溶液浓度的平均值，为0.517 mg/L；xi为第i次测量的标准曲线浓度。

标准曲线拟合引入不确定度为A 类评定，样液测定浓度在0.17～0.235 mg/L，每个样品重复10次测定，标准曲线拟合引入不确定度和相对相对不确定度计算结果见表5。由结果可知氯氰菊酯在测定浓度为0.172 mg/L 时，引入测量不确定度为7.93 %，水胺硫磷、氯唑磷、甲基对硫磷引入测量不确定度均大于5.0%。

表5 标准曲线引入的相对标准不确定度Table 5 Relative standard uncertainty introduced by the standard curves

假设1：在同一条件下测定同一样品n次，考察了测量次数与不确定度的关系，利用测量次数和相对不确定度作图2。随着测量次数的增加，样品测量由标准曲线拟合引入的不确定度降低，样品测量次数在3～4次时，不确定度的变化不明显。结果说明，在检测工作中，测量结果如出现阳性检出时，样品需要平行测量3次以上才能得到较可靠的结果。

图2 样液测量次数与标准曲线拟合引入相对不确定度的关系Fig.2 Relationship of the relative uncertainty resulting from the measurement times of the sample liquid and the fitting of the standard curve

假设2：在同一条件下测定不同阳性样品，每个样品重复10次，考察了测量不同样液检出浓度（0.05～1 mg/L）与不确定度的关系，利用测量浓度和相对不确定度作图3，随着检测浓度的增加，标准曲线引入的相对不确定度urel（R）降低，当样液测定浓度为0.3 mg/L 时，各化合物urel（R）均小于5.0%，但样液测定浓度为0.05 mg/L 时，由各化合物urel（R）相对较高。并不是样液测定浓度越高测定结果越可靠，当样液浓度继续升高，设备单位检测灵敏性会下降或者检测器出现过载，样液浓度和检测器信号成下抛弧线，造成测量结果偏低的风险。

图3 样液检出浓度与标准曲线拟合引入相对不确定度的关系Fig.3 Relationship of the relative uncertainty introduced by the detected concentration of the sample solution and the standard curve fitting

结果说明，在测定中，样液测定浓度在标准曲线平均浓度附近时，检测结果较可靠，不同浓度的样品要使用合适的标准曲线定量或者通过样品稀释、浓缩等方式让样液检测浓度在合适的范围内进行测定。

2.4 样液峰面积测定重复性引入的不确定度urel（A）

方法采用内标法定量，进样量的体积误差不会对检测带来测量不确定度，主要考虑仪器对各组分的测量稳定性，分析各目标物与内标物峰面积的比值的测量偏差，用来评定仪器测量重复性引入的不确定度的程度。

茶叶样品经过1.3 步骤处理成样液后，添加加入一定量农药成分，制备成模拟阳性检样品，上机样液溶度为0.1～0.3 mg/L 为宜，采用统计方法评定不确定度，通过在重现性、重复性条件下，连续重复测试农药分面积与内标物分面积比10次，利用贝塞尔式（4）计算出峰面积比标准偏差S（A）、式（5）计算出不确定度urel（A），结果见表6。

表6 样品溶液峰面积测定重复性引入的不确定度Urel（A） （n=10）Table 6 Uncertainty Urel (A) of repetitive ability (n=10)

结果可知，甲拌磷、氯唑磷等9 个农药由样品溶液峰面积测定重复性引入的不确定度为0.5%～2.56%，其中菊酯类农药引入不确定度较大，氯氰菊酯引入的不确定度达2.56%。分析可知峰面积测定重复性引入的不确定度主要和仪器的稳定性、灵敏度有关，也和农药的自身性质有关。比如氯唑磷和水胺硫磷这两个农药的稳定性不如其他农药，在检测分析中容易发生分解，增加了不确定度的引入；再比如氯氰菊酯、氰戊菊酯等菊酯存在异构体，工作站对异构体积分计算峰面积加和时也会引入不确定度；仪器的状态，如进样口衬管、色谱柱柱效、离子源污染程度都会引起峰面积的测量不确定度的增加。

2.5 检测回收率urel（Q）

添加回收率引入不确定度为A 类评定，采用在茶叶中分别加入浓度为方法1（0.10、0.20、0.50 mg/kg），方法2（0.02 、0.05 、0.10 mg/kg）的目标分析物，每个添加水平重复6次。为扣除标准曲线拟合带入的不确定度，采取使用标准曲线上浓度值较接近点浓度单点定量，计算回收率，结果见表7。

表7 回收率引入的相对标准不确定度Table 7 Relative standard uncertainty introduced in the recovery rate

利用式（21）计算回收率引入的相对不确定度[urel（Q）]，式中n 为回收率独立样本个数18，S（Q）为回收率标准偏差为回收率平均值。按式（22）对上述结果进行显著性检验，在95%置信区间，自由度为17 时，t分布临界值t0.95（17）=2.110，当检验值t≥2.110 时，则与回收率有显著性差异，需要使用回收率修正结果，反之不需要[20]。

2.6 相对不确定度的合成

统计上述各不确定度分量，结果见表8～表9，各农药的合成相对不确定度urel（X）由各分量相对不确定度按公式（23）计算合成而得，结果见表8。

由表8～表9可知，两个方法的合成不确定度引入量有差异，其中B 类不确定度分量中，由于前处理不同而引入不同量，A 类不确定度分量中主要是方法的原理不一样，由于方法中农药的提取效率，基质影响等因素造成回收率引入不确定度的差异。

表8 B 类评定不确定度的构成Table 8 Composition of class B

表9 A 类评定不确定度的构成和合成相对不确定度Table 9 Composition and synthesis of class A

从整个合成不确定度过程分析来看，各分量合成不确定度贡献最大的是标准曲线拟合引入不确定度、回收率引入不确定度和标准溶液配制引入；标准溶液配制引入不确定度分量主要为混合标准工作液配制引入引起，标准品的配制过程不容忽视；通过测算，样液的测量浓度很低时，标准曲线拟合引入贡献很大；回收率引入不确定度最为重要，它也是我们在日常检测工作的质控手段之一，通过它的值来评价方法的准确度，回收率的好坏受方法原理、农药性质、人员操作、试剂耗材等多方面的影响。农药残留检测值即使不折算回收率，其对检测结果的准确度也存在影响，原因是回收率折算的是平均残留值，但其对检测结果的偏差无法被忽略[19]。

2.7 不确定度的表示

根据测量不确定度评定指南要求，在95%置信水平时，取子k=2，在0.15 mg/kg 添加水平下，每个水平重复6次，当回收率在满足方法要求时，各农药在茶叶样品中的扩展不确定度[28]，见表10。

表10 茶叶中9 种农药残留的检测结果不确定度Table 10 Uncertainty of 9 pesticide residues in tea leaves

2.8 实际样品分析中不确定度评定

在实际样品检测中，对于农药残留值为最大允许残留值附近时，测量不确定的正确引入可决定该样品是否超标，这对实验室和企业都非常重要。在分析检测中，方法GB/T 23204-2008 和方法GB/T 23200.113-2018 都为茶叶中农药残留检测的推荐方法，方法的选择可能会影响检测结论。GB/T 23200.113-2018 由于具有简单、快速、高效且成本低的特点，广泛被作为实验室的第一方法来使用，由表11可知，由于方法的稀释倍数为7.5，甲拌磷、氯唑磷、甲基对硫磷、氰戊菊酯5 个农药，如果检出浓度为MRLs时，样液的理论检测浓度在0.027 mg/L 以下，最低至0.0027 mg/L，在实际检测分析中，由于仪器灵敏度和回收率的影响，样品检测结果的不确定度很大，对检测结果的判定存在很大的风险，建议这5 个药使用GB/T 23204-2008 检测分析。

表11 方法GB/T23204 和方法GB/T 23200.113-2018 比较Table 11 Comparison of method GB/T23204 and the method GB/T 23200.113-2018

哒螨灵、氯菊酯、氯氰菊酯、氟氯氰菊酯在GB 2763-2021 食品中农药最大残留限量上的允许最大残留较高，分别为5、20、20、1 mg/kg。较高浓度的样液进入仪器后会造成色谱柱的过载、检测器过载，产生测量误差，建议使用GB/T 23200.113-2018 方法，同时采用增加乙酸乙酯的复溶体积和内标物的添加量，控制内标物浓度和标液中内标物浓度基本一致为宜。

3 讨论

通过气相色谱质谱联用法，采用不同方法分析评估茶叶中哒螨灵等9 种农药残留含量测定过程中的不确定度，实验过程中对标准物质的配制、样品称量、样品提取、净化、测量等过程会引入不确定度进行分析，分析评定合成不确定度过程，可知不确定度贡献主要来自标准曲线拟合、样品添加回收率和标准溶液配制，对实验结果的影响较大，其次是样品测量重复性，在极低测量浓度时，影响最为明显。

在分析检测中，方法GB/T 23204-2008 和方法GB/T 23200.113-2018 都为茶叶中哒螨灵等9 种农药残留检测的推荐方法，方法的选择可能会影响检测结论。建议甲拌磷、氯唑磷、甲基对硫磷、氰戊菊酯5 个农药，使用GB/T 23204-2008 检测分析；哒螨灵、氯菊酯、氯氰菊酯、氟氯氰菊4 个农药，使用GB/T 23200.1134-2018 检测分析。可通过方法优化，调节合适的检测浓度，如：茶叶中氰戊菊酯和氯唑磷在MRLs 值检出时，可适当增加样品称样量或减少定容液体积；氯菊酯和氯氰菊酯在MRLs 值检出时，可增加提取液的体积和增加定容液体积。

标准曲线拟合引入的不确定度大小与样品测量次数呈相关性，随着测量次数的增加，样品测量由标准曲线拟合引入的不确定度降低，样品测量次数在3～4次时，不确定度的变化不明显。结果说明，检测工作中，测量结果如出现阳性检出时，样品需要复测3次以上计算平均值才能得到较可靠的结果。测定中，样液测定浓度在标准曲线平均浓度附近时，检测结果较可靠，不同浓度的样品要使用合适的标准曲线定量或者通过样品稀释、浓缩等方式让样液检测浓度在合适的范围内进行测定。结果表明，选择合适的校准曲线和增加样品的测量次数，可以降低标准曲线拟合引入的不确定度影响。

回收率引入不确定度最为重要，它也是我们在日常检测工作的质控手段之一，通过它的值能够评价方法的准确度。回收率的好坏受方法原理、农药性质、样品基质、人员操作、试剂耗材等多因素干扰，造成测量结果不确定度数值增大。

4 结论

在采用气相色谱质谱法测定茶叶中的农药残留量时，需要选择合适的前处理方法，保障实验室温湿度环境条件，提高实验人员的操作水平，使用满足实验需要的量具精度，试剂耗材的纯度，做好仪器调试准备工作，以满足检验检测的需求。样品前处理中应严格控制的各个步骤，操作精确，减少样品称样量、提取液体积、定容溶液体积等引入的不确定度。使用合适的标准曲线浓度点范围，在定量软件中调整标准曲线浓度点的权重，获得更好的拟合结果，提高在MRL 值附近的测量准确度。测量结果如出现阳性检出时，样品需要复测3次以上计算平均值才能得到较可靠的结果，从而降低测定结果的不确定度，确保检测结果的置信度。