徐飞飞，李跃麒，林 珺，赖月妃，黎姿茵，林秀琴，陈颖思，吴炜亮, ，杨杏芬,

（1.南方医科大学公共卫生学院，食物安全与健康研究中心，广东省热带病研究重点实验室，粤港澳污染物暴露与健康联合实验室，广东广州 510515；2.暨南大学基础医学和公共卫生学院，广东广州 510632）

2015 年全国土壤调查结果显示，我国19.4%的农业土壤受到重金属污染，其中镉是主要的重金属污染物之一[1]。种植于受污染土壤中的农作物易富集重金属，如水稻、蔬菜在种植过程中易富集Cd[2]。对于非吸烟人群，膳食是摄入Cd 的主要途径，而大米和蔬菜是中国南方地区人群暴露Cd 的主要膳食来源[3-4]。由于Cd 的半衰期长达10～30 年，摄入Cd 易在体内蓄积而造成严重的健康损害，如骨骼、肾、神经等损伤[3,5-8]。因此，常使用风险熵评估模型对膳食Cd暴露的非致癌风险进行评估，在评估过程中一般使用食物中Cd 的浓度水平与膳食消费量计算其膳食暴露量[9]。然而，由于实际产生毒性作用的是通过膳食摄入后经消化吸收到达组织的镉浓度水平，因此目前的风险评估结果可能高估Cd 引起的健康风险。

近年来，国内外提出了多种生物可及性体外测试模型用于研究污染物在胃肠道消化过程中从食品基质释放到胃肠液中的水平[10]，如生理原理提取法（the Physiologically Based Extraction Test，PBET）[11]、荷兰公共卫生与环境国家研究院法（National Institute of Public Health and the Environment，RIVM）[12-16]、德国标准研究院法（DIN）[17]等，其均发现在消化过程中基质中的污染物并非全部被释放，而使用这些体外方法可获得污染物被机体吸收的最高浓度水平，有助于提高风险评估的精确度。目前，Cd 膳食暴露风险评估的研究主要集中于不同膳食因素[18]、烹调方式[18-20]对膳食摄入Cd 的影响，尚未系统研究食物中Cd 的生物可及性及其对风险评估的作用。课题组前期研究显示，某高镉地区蔬菜中Cd 的平均浓度水平为0.14 mg/kg，且有23.75%的样本超过食品安全国家标准GB 2762 的限量值[4]。因此，本研究以该典型环境高镉地区居民日常消费的9 种蔬菜为研究对象，探索烹调方式、金属元素含量对蔬菜中Cd 生物可及性的影响，并在风险评估过程中引入生物可及性，旨在更全面地评价通过蔬菜消费而导致的Cd 暴露对人体产生的健康风险提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

蔬菜样品于2020 年1 月，在华南某高镉区域随机采集，共4 类9 种42 份蔬菜样品。由于历史原因，该区域土壤中Cd 浓度大于1.25 mg/kg，高于GB 15618-1995《土壤环境质量标准》规定的保证农林业生产和植物正常生长的土壤临界值。采集的样品分别为叶菜类蔬菜（芥菜、白菜、麦菜、生菜和菜心）、甘蓝类蔬菜（西兰花）、鳞茎类蔬菜（韭菜）、根茎类蔬菜（大薯和萝卜）。蔬菜样品均为当地居民所种植。样品低温冷藏运输至实验室后，去除不可食部后，使用超纯水将可食部洗净，于室温沥干多余水分。之后，每份蔬菜样品称取1 kg，装入密封袋中供后续实验及检测使用。

猪胃蛋白酶、胰酶、脂肪酶、α-淀粉酶、牛血清白蛋白和粘蛋白 生化试剂，Sigma 公司；NaCl、KCl、KSCN、NaH2PO4、NaHCO3、CaCl2、MgCl2、KH2PO4、Na2SO4、尿酸和尿素（分析纯）、D-（+）-葡萄糖、D-（+）-葡萄糖胺（生化试剂） 麦克林生化科技有限公司；D-葡萄糖醛酸、牛胆汁粉 索莱宝（中国北京）公司；Cd（1000 mg/L）、115In（1000 mg/L）标准溶液以及标准物质圆白菜（GBW10014）和菠菜（GBW10015） 国家标准（北京）检测认证有限公司；烹调时所用的鲁花牌花生油 购置于当地超市，Cd 的检测结果为“未检出”。

350X 电感耦合等离子体质谱仪（ICP-MS） 美国珀金埃尔默公司；SHJ-6AB 双数显水浴磁力搅拌器 中国常州高德仪器制造有限公司；Milli-Q 超纯水机 美国Millipore 公司；MARS7 微波消解仪 培安·CEM 微波化学（中国）技术中心；Newclassic-MS205DU 分析天平（万分之一） 美国METTLER TOLEDO 公司；SevenCompactS210-S 电子pH 计美国METTLER TOLEDO 公司。

1.2 实验方法

1.2.1 烹调方法 根据当地居民的烹饪习惯，采用不同烹调方式对所采集样品进行处理。每份样品取500 g，将其切成小块后分为3 份，每份150 g，其中1 份不经烹调处理，其余2 份分别进行水煮和生炒。其中，水煮样品置于500 mL 煮沸的超纯水中，于100 ℃水煮5 min，捞出，将水弃去；生炒样品则待花生油（15 mL）温度达180～190 ℃后，加入至不锈钢平底锅中翻炒1～2 min，取出。所有样品经烹调后使用匀浆机进行匀浆备用。

1.2.2 生物可及性测定方法 采用RIVM 体外消化模型模拟蔬菜的胃肠消化过程，对蔬菜中Cd 的生物可及性进行测定，分别为口腔、胃和小肠三个阶段。模拟消化液配制参照Rotard 等[12]和Oomen 等[21]研发者所使用的成分及配比。具体流程如下：

口腔阶段：将5.0 g 样品置于50 mL 具塞三角瓶中，加入6 mL 模拟唾液，使用1 mol/L HCl 溶液将pH 调节至6.5±0.2。三角瓶置于37 ℃恒温水浴磁力搅拌器中以100 r/min 搅拌2 min。

胃消化阶段：口腔阶段结束后，加入13 mL 模拟胃液于具塞三角瓶，使用1 mol/L HCl 溶液将pH 调节至1.5±0.1。三角瓶置于37 ℃恒温水浴磁力搅拌锅中以100 r/min 搅拌2 h。

小肠消化阶段：胃消化阶段后，加入12 mL 小肠液和6 mL 胆汁于具塞三角瓶，使用1 mol/L NaOH 溶液调节pH 至7.8±0.2。三角瓶置于37 ℃水浴中以100 r/min 搅拌2 h。

消化完成后，三角瓶置于沸水中30 s，将酶灭活。使用自来水冷却至室温后，消化液及消化残渣转移至50 mL 离心管中，5000 r/min 离心5 min，取上清液，经0.22 μm 滤膜过滤后，于-80 ℃中储存待测。

1.2.3 金属元素的测定

1.2.3.1 前处理方法 蔬菜样品的前处理参照GB 5009.268-2016《食品安全国家标准 食品中多元素的测定》。首先，称取0.2～0.5 g 样品（精确到0.001 g）于聚四氟乙烯消解罐中，加入10 mL 硝酸并放置1 h，后旋紧不锈钢外套，置于微波消解仪中消解。完成后，将消解内罐取出，旋开盖子，于100 ℃赶酸30 min。最后，将消解液转移至25 mL 容量瓶中，使用超纯水进行定容。

使用0.22 μm 滤膜过滤经消化后所得的消化液，取1 mL 并直接加入100 μL 硝酸后，使用超纯水定容至2 mL。

1.2.3.2 分析方法 蔬菜样品中元素的测定参照GB 5009.268-2016《食品安全国家标准 食品中多元素的测定》，使用电感耦合等离子体质谱（ICP-MS）分别对蔬菜样品中的Mg、K、Ca、Cu、Zn、Cd 浓度水平以及消化液中Cd 的浓度水平进行测定。蔬菜样品Cd 的浓度水平以鲜重计。

1.2.3.3 质量控制 采用一系列质量控制程序保证Cd 测定的准确性和精密度：a.进行化学试剂空白测定，以校准ICP-MS 读数的准确度；b.通过加标回收实验获得蔬菜样品和消化液中Cd 的回收率，分别为94.3%～108.4%和92.3%～99.8%；c.测定了标准物质圆白菜（GBW 10014）和菠菜（GBW10015）的Cd，结果如表1所示；d.在20次测定后使用空白和漂移标准样品维持仪器准确度；e.重复测定计算变异系数，以验证分析精度并确保样品在前处理期间无污染。

1.2.4 生物可及性的计算 蔬菜中Cd 的生物可及性是指样品在消化过程中释放至模拟消化液的浓度水平与样品中Cd 的浓度水平的比值，计算公式如下：

式中：BAS 为Cd 的生物可及性；CIV为消化液中Cd 的浓度水平，mg/L；VIV为消化液体积，L；Cv为蔬菜样品中Cd 的浓度水平，mg/kg；M 为蔬菜样品的质量，kg。

1.2.5 健康风险评估 采用每日估计摄入量（Esti mated daily intake，EDI）及目标风险熵（Target Hazard Quotient，THQ）评估环境高镉地区居民通过消费蔬菜摄入Cd 的健康风险。若THQ＜ 1，表明无显著健康风险。反之，则存在健康风险。EDI 和THQ 的计算公式如下：式中：Cv为蔬菜样品中Cd 的浓度水平，mg/kg；Wv为每日蔬菜消费量，kg/d；BEDI 是指经生物可及性校正后的每日估计摄入量；BAS 为Cd 的生物可及性；BW 为平均体重，kg。本研究采用的平均体重以及蔬菜消费量为课题组前期于环境高镉地区开展膳食调查得到的数据。其中，成人的平均体重为54.80 kg，成人每日蔬菜平均消费量为374 g/d，P95值为997 g/d（P95 值代表高消费人群的摄入量）。

式中：Efr是暴露频率（365 d）；ED 为暴露持续时间（70 年）；RfD 为每日口服参考剂量（mg/kg）；AT 是非致癌物质的平均时间（365 d/年×ED）；10-3是单位换算系数；BTHQ 是指经过生物可及性校正后的目标风险熵。根据美国环境保护局的数据，Cd 的每日经口暴露参考剂量为0.001 mg/kg[22]。

1.3 数据处理

所有实验均重复3次。相关数据采用SPSS 21.0 进行数据处理。所有数据采用平均值或者平均值±标准偏差的形式表示。组间比较采用方差分析，相关性采用Pearson 和Spearman 相关分析。当P＜0.05 时，差异具有统计学意义。

2 结果与分析

2.1 蔬菜中的矿物元素及Cd 浓度水平

样品中Mg、K、Ca、Cu、Zn 及Cd 的浓度水平如表2所示。蔬菜样品中主要元素的平均浓度水平为K（1.32～4.54 g/kg）＞Ca（0.04～0.76 g/kg）＞Mg（0.06～0.26 g/kg）＞Zn（1.27～6.93 mg/kg）＞Cu（0.10～1.64 mg/kg）。蔬菜样品中重金属Cd 的平均浓度范围为0.02～0.30 mg/kg，叶菜类和根茎类蔬菜的Cd浓度水平较高，其中麦菜的Cd 平均浓度最高，达0.30 mg/kg，高于标准限量值0.20 mg/kg，其次为生菜（平均浓度为0.15 mg/kg）和菜心（平均浓度为0.09 mg/kg）。不同种类蔬菜中重金属Cd 的浓度水平差异较大。其中，叶菜类蔬菜的麦菜、生菜和菜心的Cd 含量较高，提示叶菜类蔬菜较其他种类蔬菜更易富集重金属Cd，与Chen 等和侯胜男等的研究结果相似[23-24]。此外，Zhuang 等[25-26]的研究结果提示，除叶菜类蔬菜外，根茎类蔬菜亦较易累积Cd。值得注意的是，本次研究采集的根茎类蔬菜大薯中的Cd 浓度水平也较高，可能是由于根茎类蔬菜的可食用部分生长于土壤中，相比于其他类蔬菜更容易富集Cd[27]。

表2 环境高镉地区常见蔬菜中主要元素和Cd 的浓度水平（x±s）Table 2 Average concentrations of major elements and cadmium in commonly consumed vegetables collected from a high-level environmental Cd region (x±s)

2.2 烹调方法对蔬菜中Cd 浓度水平的影响

对每种蔬菜分别采用水煮和生炒2 种烹调方式进行处理，烹调方法对Cd 浓度水平的影响如图1所示。结果表明，水煮蔬菜的Cd 浓度范围为0.02～0.12 mg/kg，而未经烹调和生炒蔬菜样品的Cd 浓度范围分别为0.03～0.24 和0.03～0.21 mg/kg。与未经烹调的相应蔬菜样品比较，烹调方式水煮显著降低各类蔬菜Cd 的平均浓度水平（P＜0.05）。其中，芥菜经水煮后的平均下降比例最高，约为45.73%，其次为萝卜和大薯，平均下降比例分别为36.83%和35.02%。然而，烹调方式生炒对蔬菜Cd 浓度水平的影响则未见显著性差异（P＞0.05）。水煮可显著降低蔬菜中Cd 的浓度水平的原因可能是水煮过程中Cd 从蔬菜析出至水中，从而降低了蔬菜中的Cd 含量，结果与Mnisi 等[19]和Zhuang 等[26]的研究结果一致。由于生炒过程中水分损失较少，而且植物组织软化程度也较水煮低，因此与烹调前的蔬菜相比Cd 浓度无显著变化。

图1 不同烹调方式对蔬菜中Cd 浓度水平的影响Fig.1 Effects of different cooking methods on the cadmium concentrations in vegetable samples

2.3 蔬菜中Cd 的生物可及性

如表3所示，未经烹调的蔬菜样品中Cd 的生物可及性范围为4.44%～40.86%，其中西兰花的Cd 生物可及性最高，达40.86%，其次为芥菜（32.64%），菜心和大薯的Cd 生物可及性最低，分别为12.92%和4.44%。经水煮后，蔬菜中Cd 的生物可及性显著增加（P＜0.05），其生物可及性变化范围为5.36%～55.33%。其中，菜心样品经水煮后，Cd 的生物可及性增加0.88 倍。对于烹调方式生炒而言，烹调前后Cd 的生物可及性变化无显著性差异（P＞0.05）。对于蔬菜中Cd 生物可及性而言，水煮可使蔬菜中Cd 的生物可及性明显增加，与Pelfrêne 等的研究结果相近，这可能归因于水煮过程中植物组织由于细胞壁膨胀、果胶溶解/解聚和细胞分离而软化，因此植物组织可在消化过程中受到一定破坏而将Cd 更完全地释放[28]。然而，Fu 等的研究结果显示水煮的烹调方式可显著降低蔬菜中Cd 的生物可及性，这可能是因为相关研究所采用的烹调时间较长，或在水煮过程中加入盐，从而可能会导致更多的Cd 释放至水中，导致水煮过程中蔬菜初始浓度下降比例较高，从而掩盖了体外消化过程的影响[18-19,26]。

表3 烹调前后蔬菜中Cd 的生物可及性（x±s）Table 3 Cd bioaccessibility of vegetables before and after different cooking methods (x±s)

Zhuang 等[26]对生菜、马铃薯等6 种蔬菜中Cd的生物可及性进行了研究，其范围在35%～66%之间，而Pelfrêne 等[28]通过体外消化模型UBM 而得到的韭菜、法国豆、胡萝卜等7 种蔬菜中Cd 的生物可及性范围为63%～72%。与上述两项研究结果相比，本研究通过RIVM 体外消化模型得到的蔬菜中Cd 的生物可及性略低，可能是由于所使用的体外消化方法不同以及蔬菜样本中Cd 浓度水平的差别所造成的。Aziz 等通过体外消化模型得到的蔬菜中Cd 的生物可及性为7.21%～63.62%，与本次研究的Cd 生物可及性范围较为接近[29]。此外，本研究表明不同种类蔬菜中Cd 的生物可及性存在一定的差异，甘蓝类＞块根类＞叶菜类＞块茎类，与Hu 等[20]的研究结果一致。

2.4 蔬菜中主要矿物元素对Cd 生物可及性的影响

相关性分析结果显示，环境高镉地区蔬菜样品中矿物元素浓度水平与烹调前后Cd 的浓度水平、Cd 生物可及性的相关关系如表4所示。蔬菜样品中矿物元素与Cd 的浓度水平之间相关关系不具有统计学意义。蔬菜样品中矿物元素、Cd 浓度水平与Cd 的生物可及性的关系为：K 的含量和未经烹调蔬菜Cd 的生物可及性存在极显著负相关关系（P＜0.01），而Cu 的含量和烹调前蔬菜Cd 的生物可及性、水煮后蔬菜Cd 的生物可及性存在显著负相关关系（P＜0.05）。烹调前Cd 的浓度水平与烹调前Cd 的生物可及性、水煮后Cd 的生物可及性存在显著负相关关系（P＜0.05；P＜0.01）；烹调前Cd 的生物可及性、水煮后Cd 的生物可及性以及生炒后Cd 的生物可及性两两之间存在极显著正相关关系（P＜0.01）。

表4 蔬菜中主要矿物元素与Cd 及其生物可及性之间的相关性Table 4 Correlations of the major mineral elements with Cd and Cd bioaccessibility in vegetable samples

本研究未发现蔬菜样品中Cd 的浓度水平与矿物元素之间存在显著的相关关系。然而，Cd 的生物可及性与样品中的Cu、K 之间存在显著的负相关关系，可能是由于这些金属离子表现出与Cd 相似的物理化学性质，通过影响pH 或是竞争性与蛋白结合而影响蔬菜中Cd 的溶解度[30]。相关的研究结果表明，添加CaCl2可显著降低大米和蔬菜中Cd 的生物可及性，而添加葡萄糖酸锌显著降低蔬菜中Cd 的生物可及性[18,30]，这与本文所观察到的结果较为一致。烹调前蔬菜的Cd 浓度水平与烹调前蔬菜的Cd 生物可及性和水煮后蔬菜Cd 的生物可及性存在显著的负相关关系，表明随着蔬菜样品中的Cd 浓度水平增加，食品基质中释放出镉的能力降低，从而导致释放出的Cd 浓度与初始Cd 浓度的比值下降，即其生物可及性降低。然而，相关研究结果表明Cd 浓度水平与Cd 的生物可及性之间存在显著正相关关系（P＜0.05）[28,31]，可能是因为本研究中的蔬菜样品Cd 浓度水平较低（85%的样本＜0.1mg/kg），仅代表该浓度下的相关关系，具有一定的局限性。

2.5 健康风险评估

根据前期横断面调查所得的膳食消费量和体重数据，对环境高镉地区居民消费蔬菜摄入Cd 的EDI 和THQ 进行评估，如表5所示。结果表明，在使用常规的风险评估模型时，一般消费人群通过消费蔬菜而每日摄入Cd 的平均水平为0.55 μg/kg·bw，而蔬菜高消费人群每日摄入Cd 的平均水平为1.47 μg/kg·bw。2010 年，联合国粮农组织/世界卫生组织食品添加剂联合专家委员会（JECFA）制定了Cd 的膳食暴露健康指导值，即Cd 的每月容许摄入量（PTMI）为25 mg/kg·bw[32]。通过换算，蔬菜高消费人群的Cd 每日摄入量已高于JECFA 建立的健康指导值。相比较而言，在风险评估过程中引入Cd 的生物可及性，则发现一般消费人群通过蔬菜而每日摄入Cd 的平均水平为0.12 μg/kg·bw，高消费人群每日摄入Cd 的平均水平为0.31 μg/kg·bw，均低于JECFA设定的健康指导值，提示其引起人体健康风险的可能性较低。同样地，如表5所示，根据每日消费蔬菜摄入Cd 的平均水平得到一般消费人群的平均THQ 为0.55，高消费人群的平均THQ 为1.47。在考虑Cd的生物可及性时，一般消费人群的平均THQ 为0.12，高消费人群的平均THQ 为0.31。引入生物可及性后，高消费人群的平均THQ 小于1，提示蔬菜中Cd 经消化吸收后其对人体的危害降低，总体而言，当前的结果提示食用蔬菜摄入Cd 引起的健康风险较低。

表5 环境高镉地区居民通过消费蔬菜每日摄入Cd 的水平（μg/kg·bw）及其风险熵Table 5 EDI (μg/kg·bw) and THQ of Cd for local residents in high-level environmental Cd region via vegetable consumption

通过前期调查所获得蔬菜消费量以及当地人群的体重，计算出的当地通过食用蔬菜获得的EDI 为生菜＞菜心＞大薯＞韭菜＞大白菜＞麦菜＞芥菜＞西兰花＞萝卜。对于居住于该环境高镉地区的一般人群而言，除生菜外，通过其他蔬菜摄入Cd 的水平均低于健康指导值。相反，对于高消费人群，除了萝卜、西兰花和芥菜外，通过其他蔬菜消费而暴露Cd 的水平均高于PTMI。烹调方式对蔬菜的EDI 无明显影响，但将Cd 的生物可及性引入膳食暴露评价模型，可使因消费蔬菜而摄入Cd 的暴露量明显降低，除该地区的高消费人群通过消费生菜摄入Cd 的暴露水平高于健康指导值外，消费其他蔬菜的BEDI 均低于PTMI。同样地，除萝卜、西兰花、芥菜和麦菜外，高消费人群的THQ 均大于1。然而，考虑Cd 的生物可及性后，高消费人群消费除生菜外的其他蔬菜摄入的Cd 所造成的健康风险较低，因BTHQ 均小于1。但值得注意的是，通过蔬菜摄入的Cd 仅是膳食Cd 暴露的一部分，前期有研究提示通过大米暴露Cd 可能会造成一定的潜在健康风险[4,16,33]，因此环境高镉地区居民因膳食暴露Cd 而带来的健康风险仍较高，需引起高度关注。

3 结论

本研究以典型环境高镉地区为研究区域，对当地种植的9 种常见蔬菜中五种金属元素（Mg、K、Ca、Cu、Zn）及Cd 进行检测，采用体外RIVM 胃肠消化模型测定蔬菜中Cd 的生物可及性，评估通过消费蔬菜摄入Cd 对人体造成的健康风险。结果表明，水煮可以降低蔬菜中的Cd 浓度水平，并对Cd 的生物可及性有明显影响。利用相关分析发现，蔬菜中的K 和Cu 显著影响蔬菜中Cd 的生物可及性。若不考虑生物可及性，摄入所采集的蔬菜样本对当地一般人群造成的健康风险较低，但可能导致高消费人群的健康风险。若将生物可及性的数据纳入计算，除生菜外其余蔬菜的高消费人群的BTHQ 均低于1，提示食用蔬菜引起健康风险的可能性较低。然而，仍应关注环境高镉地区人群其他膳食来源的Cd 暴露水平以及总体情况是否可造成慢性长期暴露而引起的健康风险。