时凤翠，于晓涵，韩坤宸，郑文轩，李锐定，宋 瑶，廖艳婷，李全阳

（广西大学轻工与食品工程学院，广西南宁 530004）

广西巴马县是世界知名的长寿之乡，长寿现象凸显。根据2020 年第七次全国人口普查数据显示，巴马瑶族自治县100 岁及以上老人比例为43 人/10万人，远高于中国老年学和老年医学学会组织对“长寿之乡”的认定标准（11 人/10 万人）。本团队前期对广西长寿人群饮食特征进行了调研，巴马地区传统饮食主要以植物性食物如粗杂粮、蔬菜和水果等食物摄入为主，膳食纤维摄入量相对较高[1-2]，认为膳食纤维对长寿现象的形成联系紧密。依据前期调研结果，结合中国居民膳食营养素推荐摄入量，本团队总结出了反映长寿人群饮食特征的食谱。对反映长寿人群饮食特征的食材，利用该食谱结合营养素摄入量与能量限制的因素进行研究，发现该食谱具有良好的抗衰老作用和开发潜力[3-4]，但其中膳食纤维从中发挥了多大作用还未做研究。

膳食纤维（dietary fiber, DF）被人类称为“第七大营养素”，具有缓解便秘、维持肠屏障完整性、调节血糖血脂代谢、降低胆固醇、防治癌症、增强免疫功能等作用[5-7]。目前，关于膳食纤维的提取及特性分析已被广泛研究，千春录等[8]采用酶-碱法对水芹中膳食纤维进行提取优化；Jia 等[9]通过酶-化学法提取优化毛木耳中膳食纤维；Kurek 等[10]以藜麦、苋菜和小米三种膳食纤维为研究对象，采用酶、酶超声和超声法提取并探究了其不同理化性质与营养参数，这些报道多是以某种或者某几种膳食纤维为研究对象，关于一个具体食谱中所有代表性膳食纤维的复合体作为研究对象目前尚未见报道。

本团队前期针对广西长寿人群膳食中谷物和果蔬膳食纤维的益生效果进行了研究，聂梦琳等[11]采用酶-碱法提取优化火麻中膳食纤维，发现火麻膳食纤维具有良好的益生特性，饶川艳等[12]发现广西长寿人群膳食中代表性膳食纤维具有显著的抗氧化效果，然而食谱中膳食纤维通常为多种食材组成的复合体，研究膳食纤维复合体能更真实地反映食谱的饮食特征。因此，为了探究膳食纤维在食谱中发挥作用的机制，本文以食谱中代表性膳食纤维红薯叶、枸杞叶、苦麦菜、空心菜、香蕉、芭蕉、沃柑、芋头等[2]8 种作为原料，进行不同比例的复合，采用超声波辅助酶法进行提取，通过单因素和响应面试验探究TDF得率最高时的工艺参数，然后对提取产物进行基本成分和理化性质分析，以期为长寿地区特色功能性产品的开发提供理论支持。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

红薯叶、枸杞叶、苦麦菜、空心菜、香蕉、芭蕉、沃柑、芋头、金龙鱼花生油 当地农贸市场；α-淀粉酶（CAS9000-90-2，4000 U/g） 上海江莱生物科技有限公司；α-淀粉酶溶液（CAS9000-85-5，10000±1000 U/mL）、淀粉葡糖苷酶溶液（CAS9032-08-0，2000～3000 U/mL）、蛋白酶溶液（CAS9014-01-1，300～400 U/mL） 嘉兴思成化工有限公司；95%乙醇 成都市科隆化学品有限公司；草酸铵 天津市科密欧化学试剂有限公司；硼氢化钠 天津欧博凯化工有限公司；冰醋酸 天津新技术产业园区科茂化学试剂有限公司；其他试剂 均为国产分析纯。

XT-A400 型多功能粉碎机 永康市红太阳机电有限公司；WGL-125B 电热鼓风干燥箱 天津市泰斯特仪器有限公司；HH-4 数显恒温水浴锅 金坛区水北科普实验仪器厂；KQ-800DE 数控超声波清洗器昆山市超声仪器有限公司；RE-2000A 旋转蒸发器上海亚荣生化仪器厂；TG16-WS 台式高速离心机湖南湘仪实验室仪器开发有限公司；UP-FG-1 台式冷冻干燥机（多歧管压盖型） 上海优普实业有限公司；K-375 全自动凯氏定氮仪 上海沃珑仪器有限公司；HYP-314 十四孔智能消化炉 上海纤检仪器有限公司；SZF-06C 脂肪测定仪 浙江托普仪器有限公司；SX2-10-13 马弗炉 上海实研电炉有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 材料预处理 红薯叶、枸杞叶、苦麦菜、空心菜、芋头：将红薯叶、枸杞叶、苦麦菜、空心菜、芋头分别进行清洗、切段，然后置于电热鼓风干燥箱中65 ℃烘干，烘干后进行粉碎，最后过筛后备用。

芭蕉、香蕉、沃柑：将芭蕉、香蕉、沃柑分别进行剥皮、切片，然后置于电热鼓风干燥箱中65 ℃烘干，烘干后进行粉碎，最后过筛后备用。

1.2.2 超声波辅助酶法提取广西膳食纤维工艺

1.2.2.1 工艺流程 本文采用超声波辅助酶法提取广西膳食纤维，提取工艺流程设计如图1所示：

图1 广西长寿地区代表性膳食纤维提取工艺流程图Fig.1 Process flow chart of representative dietary fiber extraction in longevity area of Guangxi

1.2.2.2 操作要点 准备过筛后的不同种类原料粉末，以本团队对前期获得的长寿人群食谱[3-4]为依据，经计算获得红薯叶、枸杞叶、苦麦菜、空心菜、香蕉、芭蕉、沃柑、芋头的复合比例为1.4:1.3:0.98:0.8:11.5:5.4:1.3:7.4，这就构成了长寿人群膳食纤维复合体（dietary fiber complex，DFC）的初级混合物，将初级混合物充分混匀后按照一定液料比加入蒸馏水，置于100 ℃水煮沸5 min，冷却至室温后添加一定量的α-淀粉酶（CAS9000-90-2，4000 U/g），调整pH 至5.0，调整合适的超声波功率辅助酶解20 min，放置于水浴锅中在一定时间温度和时间内进行提取，然后在100 ℃水浴中灭酶10 min，于8000 r/min 离心15 min，沉淀物经真空冷冻干燥后得不可溶性膳食纤维（insoluble dietary fiber, IDF）；上清液加入4 倍体积95%乙醇进行醇沉，于8000 r/min 离心10 min，沉淀物经真空冷冻干燥得可溶性膳食纤维（soluble dietary fiber，SDF），IDF 和SDF 得率分别以下列公式计算。

1.2.3 单因素实验 固定液料比20 mL/g、提取时间90 min、提取温度70 ℃、添加0.3%α-淀粉酶和超声波功率240 W 为单因素实验条件，按照1.2.2 节超声波辅助酶法，以总膳食纤维（TDF）得率为评价指标，选择液料比（10、15、20、25、30 mL/g）、提取时间（60、90、120、150、180 min）、提取温度（50、60、70、80、90 ℃）、α-淀粉酶添加量（0.2%、0.3%、0.4%、0.5%、0.6%）、超声波功率（80、160、240、320、400 W）5 个因素进行单因素实验，考察各因素对TDF 得率的影响，每个单因素实验平行重复3次，结果取平均值。

1.2.4 响应面试验优化广西长寿人群食谱中膳食纤维复合体的提取工艺 在单因素实验的基础上，选择α-淀粉酶添加量、超声波功率、液料比和提取温度为因素，TDF 得率为响应值进行试验，并进行数据拟合优化广西长寿人群食谱中DFC 的提取工艺，试验因素与水平设计见表1。

表1 响应面试验因素与水平Table 1 Factors and levels used for response surface design

1.2.5 基本成分测定

1.2.5.1 水分含量的测定 参考GB 5009.3-2016《食品安全国家标准食品中水分的测定》[13]。

1.2.5.2 灰分含量的测定 参考GB 5009.4-2016《食品安全国家标准食品中灰分的测定》[14]。

1.2.5.3 蛋白质含量的测定 参考GB 5009.5-2016《食品安全国家标准食品中蛋白质的测定》[15]。

1.2.5.4 脂肪含量的测定 参考GB 5009.6-2016《食品安全国家标准食品中脂肪的测定》[16]。

1.2.5.5 果胶、纤维素、半纤维素和木质素含量的测定 参考Ma 等[17]和Capek 等[18]的方法并进行修改，将待测样品（Y）与0.25%草酸铵溶液按1:10 m/v的比例混匀后，于90 ℃水浴中连续搅拌2 h，离心收集上清液，重复以上操作两次，合并上清液，装入透析袋（截留分子量：7000 U）中透析至与去离子水的电导率相同，收集截留液冷冻干燥，得到果胶类物质（A1）。上述滤渣依次用80%乙醇洗涤2次，用蒸馏水洗涤3次后，冷冻干燥，在室温下，将冻干后的残渣与含有0.1%硼氢化钠的氢氧化钾溶液（4 mol/L）按1:30 m/v 的料液比混合，搅拌提取24 h 后过滤，滤液采用醋酸溶液（4 mol/L）中和后，用透析袋透析至与去离子水的电导率相同，截留液冷冻干燥，得到半纤维素（A2）；过滤后的残渣洗涤后冻干得样品A3；向A3中按1:1 m/v 的比例加入浓硫酸溶液（72%，m/m），于4 ℃冰箱中浸提24 h，依次经过滤、洗涤、干燥得样品A4，其中，灰分质量为A5。

式中：A1是果胶类物质的质量，g；A2是半纤维素的质量，g；A3是将A2过滤、洗涤、冻干后沉淀物的质量，g；A4是将A3过滤、洗涤、干燥后沉淀物的质量，g；A5是灰分质量，g。

1.2.5.6 膳食纤维含量的测定 参考GB 5009.88-2014《食品安全国家标准食品中膳食纤维的测定》[19]。

1.2.6 理化性质测定

1.2.6.1 持水力的测定 参考He 等[20]的方法并略作修改，精确称取0.5 g（m1）的TDF、SDF、IDF 试样，置于50 mL 离心管中，加入10 mL 蒸馏水，振荡混匀后，室温下静置24 h，5000 r/min 离心20 min，弃去上清液后称质量（m2）。

式中：m1是TDF、SDF、IDF 初始样品的质量，g；m2是TDF、SDF、IDF 持水后样品的质量，g。

1.2.6.2 膨胀力的测定 参考Ghribi 等[21]的方法并略作修改，精确称取0.5 g（m1）的TDF、SDF、IDF 试样，置于10 mL 量筒中，读取体积V1，加入5 mL 蒸馏水，振荡混匀后，室温下静置24 h，试样吸水膨胀后读取体积V2。

式中：m1是TDF、SDF、IDF 初始样品的质量，g；v1是将TDF、SDF、IDF 样品置于量筒后的体积，mL；v2是TDF、SDF、IDF 样品吸水膨胀后的体积，mL。

1.2.6.3 持油力的测定 参考Wang 等[22]的方法并略作修改，精确称取1 g（m1）的TDF、SDF、IDF试样，置于50 mL 离心管中，加入花生油，振荡混匀后，室温下静置12 h，5000 r/min 离心20 min，弃掉上层油脂后称质量（m2）。

式中：m1是TDF、SDF、IDF 初始样品的质量，g；m2是TDF、SDF、IDF 持油后样品的质量，g。

1.2.6.4 乳化能力及乳化稳定性的测定 参考任庆等[23]的方法并略作修改，精确配制质量浓度0.1 g/mL的TDF、SDF、IDF 试样溶液，取10 mL 加入到离心管中，读取液体总高度h1，再向离心管中加入5 mL花生油，均质成乳化液，离心后读取离心管中乳化层的高度h2；将离心管置于85 ℃水浴锅内保持30 min，离心后再次读取离心管中的乳化层高度h3。

式中：h1是TDF、SDF、IDF 初始试样溶液置于离心管的高度；h2是均质、离心后乳化层的高度；h3是水浴、离心后乳化层的高度。

1.3 数据处理

采用Design-Expert 10.0.7 设计响应面、Origin 2018 绘图和IBM SPSS Statistics 24 进行数据处理，并设置3次平行试验，以平均值±标准差（Mean±SD）表示，P＜0.05 表示具有显著性差异。

2 结果与分析

2.1 单因素实验结果

2.1.1 液料比对广西长寿人群食谱中膳食纤维复合体提取效果的影响 由图2可知，随液料比增加，TDF和IDF 得率总体呈先上升后下降的趋势，这可能是由于在一定范围内液料比的增加会增大膳食纤维与蒸馏水间的接触面积，从而提高IDF 的溶出率，故IDF 得率增加；而当液料比大于15 mL/g 时，IDF 得率逐渐下降，这可能是由于IDF 溶出速率已经接近于零，溶液体系达到平衡状态，如果继续增加液料比，反而可能水解溶出的IDF[24]。SDF 得率在液料比25 mL/g 时达到最大值，但无显著性差异（P＞0.05），而当液料比为15 mL/g 时，TDF 和IDF 得率有显著性差异（P＜0.05），因此在保证试验效果、节约水资源以及乙醇成本的综合考虑下，确定15 mL/g 为最佳液料比。

图2 液料比对广西长寿人群食谱中膳食纤维复合体得率的影响Fig.2 Effect of liquid-solid ratio on the yield of dietary fiber complex in the diet of longevity people in Guangxi

2.1.2 提取时间对广西长寿人群食谱中膳食纤维复合体提取效果的影响 由图3可知，TDF 和IDF 得率随提取时间的延长，呈现先上升后下降的趋势，90 min 时达到最大值，这可能是由于90 min 时，酶与底物反应接近于反应完全，如果继续增加提取时间，反而会导致IDF 发生轻度水解[25]。SDF 得率随提取时间的延长而增大，90 min 之后呈现下降的趋势，原因可能是SDF 提取存在一个最适时间，超过最适时间后容易引起多糖分子的降解。当提取时间为90 min 时，TDF、SDF 得率有显著性差异（P＜0.05），而IDF 无显著性差异（P＞0.05），因此综合考虑，确定90 min 为最佳提取时间。

图3 提取时间对广西长寿人群食谱中膳食纤维复合体得率的影响Fig.3 Effect of extraction time on the yield of dietary fiber complex in the diet of longevity people in Guangxi

2.1.3 提取温度对广西长寿人群食谱中膳食纤维复合体提取效果的影响 由图4可知，随提取温度升高，TDF、IDF 以及SDF 得率不断增大，80 ℃时达到最大值，继续升高温度，得率出现下降的趋势，原因可能是酶反应与最适温度有关，80 ℃时酶的活性达到了最大值，得率也达到最大值，如果继续提高温度，酶的活性会降低，且温度过高会导致纤维物质的降解。当提取温度为80 ℃时，TDF、IDF 和SDF 得率有显著性差异（P＜0.05），因此综合考虑，确定80 ℃为最佳提取温度。

图4 提取温度对广西长寿人群食谱中膳食纤维复合体得率的影响Fig.4 Effect of extraction temperature on the yield of dietary fiber complex in the diet of longevity people in Guangxi

2.1.4α-淀粉酶添加量对广西长寿人群食谱中膳食纤维复合体提取效果的影响 由图5可知，随α-淀粉酶添加量增加，TDF 和IDF 得率先增大后减小，当添加量为0.3%时，得率达到最大值，这可能是由于在一定范围内α-淀粉酶添加量的增加促使淀粉充分酶解，IDF 得率随之达到最大值，如果继续增加α-淀粉酶，酶的活性会趋于饱和[26]，IDF 得率也会随之下降。而SDF 得率在添加量为0.4%时，得率达到最大值，且有显著性差异（P＜0.05），当α-淀粉酶添加量为0.3%时，TDF 和IDF 得率均有显著性差异（P＜0.05），因此综合考虑节约酶的使用量，确定0.3%为最佳α-淀粉酶添加量。

图5 α-淀粉酶添加量对广西长寿人群食谱中膳食纤维复合体得率的影响Fig.5 Effect of α-amylase addition on the yield of dietary fiber complex in the diet of longevity people in Guangxi

2.1.5 超声波功率对广西长寿人群食谱中膳食纤维复合体提取效果的影响 由图6可知，随超声波功率增大，TDF、IDF 和SDF 得率总体呈先上升后下降的趋势，原因可能是超声处理会产生空化和机械作用[27]，在一定超声波功率范围内，纤维物质会快速溶出，如果继续增大超声波功率，将会破坏纤维网状结构，随之被降解掉。当超声波功率为240 W 时，TDF、IDF 和SDF 得率有显著性差异（P＜0.05），因此综合考虑，确定240 W 为最佳超声波功率。

图6 超声波功率对广西长寿人群食谱中膳食纤维复合体得率的影响Fig.6 Effect of ultrasonic power on the yield of dietary fiber complex in the diet of longevity people in Guangxi

2.2 响应面试验结果

2.2.1 Box-Behnken 试验设计及结果 在单因素实验基础上，根据5 个因素对TDF 得率产生影响的显著性大小，选择α-淀粉酶添加量、超声波功率、液料比和提取温度为因素，TDF 得率为响应值进行试验，Box-Behnken 试验设计及结果见表2。

表2 Box-Behnken 试验设计及结果Table 2 Experimental design and results for Box-Behnken

2.2.2 回归模型的建立及其显著性检验 从表3 可看出，模型极显著（P＜0.01），失拟项不显著（P＞0.05），表明该回归模型可以较好地拟合预测值与实测值，适用于对广西长寿人群食谱中膳食纤维复合体提取工艺进行分析和预测。决定系数R2为0.9140，R2Adj=0.8280，表明该回归模型可以解释91.4%的响应值，且模型具有较好的拟合度，可以准确分析和预测提取结果。用Design-Expert 10.0.7 软件对表2 数据进行多元回归拟合，得到TDF 得率（Y）对自变量α-淀粉酶添加量（A）、超声波功率（B）、液料比（C）、提取温度（D）的二次多项回归模型：Y=63.42+2.42A-0.17B+0.31C+3.56D+0.54AB-4.62AC+1.71AD-1.55BC+0.37BD+2.46CD-4.61A2-4.72B2-7.00C2-3.76D2。F值可以判定各变量对响应值影响的显著性大小，根据显著性大小决定主次顺序，结果表明：A、D、AC、A2、B2、C2、D2达到极显著水平（P＜0.01），其他均不显著（P＞0.05），各因素对响应值影响排序为：提取温度＞α-淀粉酶添加量＞液料比＞超声波功率。

表3 响应面方差分析Table 3 Analysis of variance for response surface analysis

2.2.3 响应曲面及等高线分析 等高线图和响应面图均可以直观地判断交互作用的显著程度，等高线形状越接近椭圆形且越密集，响应面越陡峭，说明交互作用越显著。与其他两因素之间的响应曲面与等高线图相比，AC 响应面更陡峭，等高线的形状更接近椭圆形，因此判断AC 交互作用更显著。由此交互项的影响从大到小排列依次为：AC＞CD＞AD＞BC＞AB＞BD，如图7所示，AC 交互作用显著，其余不显著，这与响应面方差分析结果一致。

图7 α-淀粉酶添加量与液料比交互作用对TDF 得率影响的响应面和等高线图Fig.7 Response surface and contour map of the interaction between α-amylase addition and liquid-solid ratio on the yield of TDF

2.2.4 最佳工艺平行验证试验 根据单因素实验结果以及响应面模型计算得出，广西长寿人群食谱中膳食纤维复合体（DFC）的最优提取工艺是：α-淀粉酶添加量0.34%，超声波功率242.04 W，液料比14.98 mL/g，提取温度85.50 ℃，此时TDF 最大得率为64.85%。为了试验操作的可行性，将提取条件设置为α-淀粉酶添加量0.3%，超声波功率242 W，液料比15 mL/g，提取温度86 ℃，平行3次试验，测得TDF 得率为（63.90%±1.60%），与理论预测值基本一致。因此经响应面模型计算得出的最优条件可靠，能真实地反映超声波辅助酶法对TDF 得率的影响。

2.3 DFC 基本组成成分分析

由图8可知，DFC 与优化后的DFC 中主要成分是纤维素、半纤维素和木质素，且经超声波辅助酶解提取后得到的总膳食纤维中蛋白质、脂肪等杂质含量分别由提取前的（2.66%±0.12%）、（5.31%±0.14%）降至提取后的（1.90%±0.08%）、（1.77%±0.26%），总膳食纤维含量有显著提高（P＜0.05），从（39.71%±1.17%）增加到了（64.83%±0.28%），即其纯度提高了约25.12%。8 种广西长寿人群食谱中膳食纤维复合体提取前总膳食纤维含量（39.71%±1.17%）高于甘薯渣（24.06%）[28]，且优化后，总膳食纤维含量明显高于红枣渣（26.5%左右）[29]，而目前对于膳食纤维的研究大多集中于单一膳食纤维，关于广西长寿人群食谱中膳食纤维复合体特性的研究还未见有报道。

图8 工艺优化前后提取的DFC 基本组成成分分析Fig.8 Analysis of basic components of DFC extracted before and after process optimization

2.4 DFC 理化性质分析

为了衡量DFC 品质的好坏，对其进行理化性质分析，结果如表4所示，超声波辅助酶法制备的TDF 与膳食纤维粉相比较，其持水力、膨胀力、持油力、乳化能力及乳化稳定性均有明显提高，分别提高了5.36 g/g，2.83 mL/g，3.56 g/g，21.81%，36.8%，且分离后的SDF 持水力、膨胀力、乳化能力及乳化稳定性均优于IDF，持油力则相反。制备后的DFC 中IDF 持油力为（9.06±0.23）g/g。对于膳食纤维的持油力，丁政宇等[30]报道黄精渣为（3.97±0.04）g/g、Lou等[31]报道牛蒡根粉为（8.50±0.36）g/g，比本研究结果差别明显；SDF 持水力和膨胀力分别为（10.08±0.28）g/g、（8.24±0.31）mL/g，明显高于黄秋葵（5.61 g/g、3.35 mL/g）[32]、木瓜皮（5.26 g/g、4.54 mL/g）[33]、稻壳（2.58 g/g、3.27 mL/g）[34]的有关研究，且DFC 的SDF 具有较好的乳化性和乳化稳定性，这表明DFC具有较好的工艺学属性，有利于其制品的后续开发。研究发现用等比的苦荞麦粉、绿豆粉和燕麦粉制备的抗性淀粉，对小鼠具有明显的减肥降脂作用[35]，绿豆、苦荞、藜麦复合抗性淀粉多元复合RS 有助于降低高糖高脂模型小鼠的血糖血脂水平，提高肠道内乙酸、丙酸、丁酸的含量[36]。本研究的DFC 则是8 种膳食纤维原料按照不同的比例复合，因此可以预测DFC 具有良好的潜在益生价值，这也从侧面反映了广西长寿人群食谱对人体健康的促进和保障作用。

表4 DFC 的理化性质Table 4 Physicochemical properties of DFC

3 结论

本研究采用超声波辅助酶法提取优化广西巴马长寿地区食谱中膳食纤维复合体（DFC），通过单因素实验和响应面试验探究膳食纤维最佳提取工艺。结果表明：在α-淀粉酶添加量0.3%，超声波功率242 W，液料比15 mL/g，提取温度86 ℃时，TDF 最大得率为63.90%；基本成分结果表明：DFC 与优化后的DFC中主要成分是纤维素、半纤维素和木质素，且优化后TDF 含量有显著提高（P＜0.05）；理化性质结果表明：优化后的DFC 持水力、膨胀力、持油力、乳化能力和乳化稳定性分别提高了5.36 g/g，2.83 mL/g，3.56 g/g，21.81%，36.8%，DFC 中SDF 持水力、膨胀力、乳化能力及乳化稳定性均优于IDF，持油力则相反。以上结果表明DFC 是一种优质的膳食纤维原料，在开发广西长寿地区特色功能性产品方面具有广阔的应用前景，关于其进一步的益生效果分析和广泛应用，还需要更深入地探究其结构、性质及其他功能效果之间的联系。