王明莹

(呼伦贝尔学院 内蒙古 海拉尔 021008)

苜蓿(Medicago)是多年生豆科牧草， 苜蓿种类繁多， 适口性佳， 是优良的牧草。[1]在高纬度寒冷地区， 低温使得苜蓿不能正常越冬， 从而降低了苜蓿的产量。 国内外学者在低温对苜蓿影响的研究中发现， 抗寒能力不同的植物电导率有较明显的差异。 郝培彤研究发现， 苜蓿越冬期由于根茎积累越冬保护性糖表现出较强的越冬能力， 低温时会合成大量的渗透调节物质来提高保护酶的活力， 进而提高植物的抗寒能力；[2]马维文研究越冬期白三叶的生理指标发现， 脯氨酸、 过氧化物酶、 可溶性糖随温度降低而增加， 丙二醛含量会随温度降低先下降后增加；[3]朱爱民研究发现， 苜蓿根系低温胁迫时抗氧化酶活性增加；[4]徐洪雨等研究发现， 苜蓿低温时植物细胞膜透性加大。[5]

目前，有关呼伦贝尔地区引种不同品种苜蓿比较抗寒性的研究较少，本试验有助于丰富高寒地区苜蓿资源生产、加速苜蓿新品种选育、推动地区牧草抗寒性研究。通过在呼伦贝尔地区引进的苜蓿进行田间栽培，对9种不同品种苜蓿进行低温胁迫，选取抗寒性指标进行测定与分析，从生理生化角度筛选出适合该地区种植、抗寒能力较强的苜蓿品种，这对苜蓿引种栽培具有理论指导和实践意义。

1 研究地概况

试验地区位于内蒙古呼伦贝尔市鄂温克族自治旗牧草种植基地，地处呼伦贝尔南部，北纬48°27′-48°35′，东经119°35′-119°41′。海拔高度760-770 m。年平均温度-2.4℃。年平均降水量320-400 mm，主要集中在6-8月，占全年降水量的70%以上。年蒸发量1478.8mm，年积温1952.6℃，无霜期113 d左右。试验地土壤为沙质盐化草甸土。试验采用随机区组设计，3次重复。小区试验田面积10 m2，苜蓿行距30 cm。

2 研究方法

2.1 苜蓿采集及冷处理

鄂温克族自治旗牧草种植基地采集供试的9种苜蓿，选取生长良好的各品种植株，置于4℃(低温胁迫处理)的人工气候箱中处理7天，所有处理设置3个重复，之后取出并采集叶部进行相关指标的测定，低温处理前(25℃)作为对照组。测定游离脯氨酸含量(PRO)、丙二醛含量(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)、叶绿素相对含量、相对电导率，共六项指标。

表1 供试苜蓿品种

2.2 各指标的测定方法[6]

PRO含量的测定采用酸性茚三酮法；MDA含量的测定硫代巴比妥酸法测定；SOD活性的测定采用比色法；POD活性的测定采用愈创木酚法；相对电导率的测定采用电导率仪测定法；叶绿素含量的测定使用叶绿素含量测定仪。

2.3 数据处理

试验数据用Excel进行图表绘制，用SAS软件进行统计分析，采用单因素方差分析方法进行不同品种间各指标的比较。

抗寒性综合评价：采用隶属函数法[7]综合分析。各指标隶属函数计算公式：

X1=(X-Xmin)/(Xmax-Xmin)

(1)

X2=1-(X-Xmin)/(Xmax-Xmin)

(2)

式中X1和X2为测定各指标的隶属函数值，X为各材料的指标测定值Xmin为各材料中测定指标的最小值，Xmax为各材料中测定指标的最大值。其中，PRO、SOD、POD、叶绿素含量等指标用公式(1)计算；相对电导率、MDA与耐寒性呈负相关，用公式(2)计算。将各指标求平均值，平均值越大表示耐寒性越强。

3 结果分析

3.1 不同品种苜蓿PRO含量变化

由图1中可知，9种苜蓿的PRO含量各不相同，在低温处理前PRO含量最大的是驯鹿苜蓿，低温处理后9种苜蓿的PRO含量都大幅度增加，其中新苜和阿尔冈金PRO含量变化较大。驯鹿PRO 含量增加了46.15%，低温处理后龙苜806的PRO 含量最少，显著低于新苜、阿尔冈金、俄罗斯杂花苜蓿和东苜2号(p<0.05)。与对照组比较，低温处理后9种苜蓿PRO含量增加的幅度由大到小依次为新苜>阿尔冈金>东苜5号>BL205>龙苜806>俄罗斯杂花苜蓿>草原2号>黄花苜蓿>驯鹿。

图1 不同品种苜蓿游离脯氨酸变化结果

3.2 不同品种苜蓿MDA含量变化

MDA含量越低表明苜蓿的细胞膜受伤程度较轻，由图2中可知，低温处理后MDA都有不同程度的增加，9种苜蓿低温处理前的MDA含量最高的是东苜2号，阿尔冈金和BL202的MDA含量最低，阿尔冈金和BL202与草原二号、驯鹿、东苜2号和黄花苜蓿存在显著差异(p<0.05)。低温处理后，MDA含量最高的是东苜2号，最少的是黄花苜蓿；与对照组比较，低温处理后MDA含量增加最多的是BL202(增加了176.9%)，处理前后MDA含量变化幅度较小的是驯鹿(增加了51.58%)和俄罗斯杂花苜蓿(增加了51.04%)。与对照组比较，9种苜蓿低温处理后MDA含量变化幅度由大到小依次是BL202>黄花苜蓿>东苜2号>草原二号>龙苜806>阿尔冈金>新苜>俄罗斯杂花苜蓿>驯鹿。

图2 不同品种苜蓿MDA含量变化结果

3.3 不同品种苜蓿SOD活性变化

当植物受到低温胁迫时，植物可以通过升高SOD活性增强对低温的适应能力。从图3中可以看出，9种苜蓿抗寒处理前SOD活性新苜与草原二号、东苜2号和龙牧806之间存在显著差异(p<0.05)。东苜2号和草原二号与新苜和BL202之间的差异显著(p<0.05)。低温处理后，草原二号、东苜2号、龙苜806、黄花苜蓿的SOD活力均升高。其中，草原二号升高幅度最大达到27.6%，SOD活性为231U/gFW，草原二号和龙苜806的SOD活性显著高于其它品种苜蓿(p<0.05)。低温处理后，SOD活力由强到弱依次是草原二号>龙苜806>新苜>黄花苜蓿>BL202>东苜2号>阿尔冈金>俄罗斯黄花苜蓿>驯鹿。

图3 不同品种苜蓿SOD含量变化结果

3.4 不同品种苜蓿POD活性变化

POD能分解过氧化物，可以避免植物细胞受伤害。从图4中可以看出，低温处理后新苜、草原二号、阿尔冈金、BL202的POD活性降低。与对照组比较，新苜POD活性降低的幅度最大(45.53%)，俄罗斯杂花苜蓿、驯鹿、东苜2号、龙苜806、黄花苜蓿的POD活力大幅度增加。其中，东苜2号POD活性增加了347%，黄花苜蓿增加了80.5%。低温处理后，东苜2号和黄花苜蓿的POD活力与其它品种苜蓿有显著差异(p>0.05)，苜蓿通过POD活性的升高保护低温对植物产生过氧化伤害。

图4 不同品种苜蓿POD含量变化结果

3.5 不同品种苜蓿叶绿素相对含量变化

低温可以影响植物叶绿素的合成与分解，从图5中可以看出，低温处理前叶绿素含量最高的是草原二号，最低的是新苜。处理后叶绿素相对含量均降低，与对照组相比，低温处理后驯鹿叶绿素相对含量降低了71.43%，其次是东苜2号31.38%。可见低温处理后叶绿素的分解大于合成。低温处理前后比较，9种苜蓿叶绿素相对含量变化率由大到小依次是驯鹿>东苜2号>草原二号>黄花苜蓿>俄罗斯杂花苜蓿>BL202>阿尔冈金>新苜>龙苜806。

图5 不同品种苜蓿叶绿素相对含量变化结果

3.6 不同品种苜蓿相对电导率变化

植物细胞膜受伤会导致电导率值增加。从图6中可以看出，低温处理后不同品种苜蓿相对电导率均表现不同幅度的增加，说明低温处理使细胞膜受到了不同程度的破坏，膜透性增加。新苜、草原二号、东苜2号、阿尔冈金、龙苜806和黄花苜蓿相对电导率与低温处理前有显著性差异。与处理前比较，9种苜蓿相对电导率上升的幅度依次为东苜2号>黄花苜蓿>驯鹿>草原二号>阿尔冈金>俄罗斯杂花苜蓿>新苜>BL202>龙苜806。

图6 不同品种苜蓿相对电导率变化结果

3.7 不同品种苜蓿抗寒性综合评价

用隶属函数法计算低温胁迫后各指标的隶属函数值，并对9种苜蓿各指标的隶属函数值求其平均值，进行排序。见表2，综合评价9种苜蓿抗寒性的强弱。在低温胁迫下，抗寒性由强到弱依次为：黄花苜蓿>草原二号>俄罗斯杂花苜蓿>龙苜806>阿尔冈金>东苜2号>驯鹿> BL202>新苜。

表2 9种苜蓿各指标隶属函数值比较

4 讨论

4.1 游离脯氨酸(PRO)含量

PRO是植物体内的渗透调节物质，低温下其含量增加能够加强其抗寒能力，抗逆性增加。在低温条件下，PRO的亲水性能稳定细胞的代谢作用，研究结果表明低温胁迫下，9种苜蓿叶片中PRO的含量都明显增加，这一结果与罗新义[8]的研究相一致。

4.2 丙二醛(MDA)含量

低温胁迫下，植物产生活性氧自由基的积累会破坏生物膜脂，引起膜脂的功能变化，影响了生物膜的通透性，进而产生乙烯类的生理生化变化，生成过氧化产物丙二醛。通过丙二醛含量的高低来反映环境对植物带来的影响，丙二醛含量越低植物就越能适应逆境。[9]低温胁迫后，9种苜蓿抗寒能力差的品种丙二醛含量变化幅度大。

4.3 超氧化物歧化酶(SOD)活性

SOD是一种重要的抗氧化酶，它能够清除植物代谢产生的自由基，可以阻断氧自由基对细胞带来的伤害，增加植物抗逆性。[10]为了更好地适应低温环境，保证安全度过逆境，植物体内的SOD含量会增多。研究表明，低温时SOD活性的增加会明显增强植物的抗寒能力，各品种的抗寒性强弱与植物体内SOD活性呈正相关，当超过其耐寒力时，SOD活性则显著下降，而且其下降的程度均可反映出苜蓿各品种耐寒力的大小。[11]因此，由图3可以判断草原二号处理前后增加最多，抗寒性强，驯鹿苜蓿降低最多，抗寒性弱。

4.4 过氧化物酶(POD)活性

POD能还原过氧化氢，从而降低了过氧化氢对植物细胞的伤害，有利于植物水分代谢和呼吸代谢，POD活性越大，其抗寒性就越强。[12][13]为了更好地适应低温环境，保证安全度过逆境，植物体内的POD活性会增多。因此，由图4可以判断，POD活性处理后较处理前升高最多的是东苜2号。因此，东苜2号苜蓿在POD活性这一指标中表现抗低温伤害的能力最强，而轻度低温处理后9种苜蓿POD活性有的降低有的升高，可能是不同品种之间低温保护能力差异导致。

4.5 叶绿素相对含量

植物叶绿素能够吸收、转化和传递光能，是植物进行光合作用的重要色素，可以反映植物营养物质的情况。植物叶片色素含量减少，光合效率降低。植物受到低温胁迫后，光合作用随之下降，同时光合色素含量降低。由图5可见，不同品种苜蓿低温处理前和处理后相比较，叶绿素相对含量发生不同程度的下降，驯鹿苜蓿的叶绿素含量下降最多，可见低温胁迫对其影响较大，低温下叶绿素合成速度小于分解速度，这与李丽菁[14]对日本结缕草的叶绿素在低温代谢变化的研究一致。

4.6 相对电导率

低温条件下，植物的细胞膜被破坏，膜透性增大，从而叶片电导率的变化可以反映出细胞膜功能的变化，可用于衡量植物抗寒能力的强弱。低温条件下对9种苜蓿进行处理后，发现电导率都有不同程度的增大。从图6可以看出，处理前后相比，黄花苜蓿的相对电导率变化最大。草原二号的变化最小，抗寒能力大，这与王晓俊[15]的研究相一致，低温对电导率的影响较大。

5 结论

本次试验共选择了9种苜蓿品种，测试其六项指标。对9种苜蓿品种的抗寒性鉴定时，不同的指标对结果的判定不同。由本文测定的几个抗寒性指标来看，低温胁迫使不同品种苜蓿的游离脯氨酸含量、超氧化物歧化酶、过氧化物酶、丙二醛、相对电导率等指标增加，而叶绿素相对含量与对照比较有不同程度的下降。综合多项指标评价得出黄花苜蓿、草原二号、俄罗斯杂花苜蓿、龙苜806抗寒能力较强。其中，黄花苜蓿抗寒能力明显优于其它品种。