李庆妮陈云丰刘元浪唐 定华婉璐张瑞安卢 佳*李新国*

(1.武汉生物制品研究所有限责任公司新发传染病研究室,武汉 430207;2.武汉生物制品研究所有限责任公司生物安全三级实验室,武汉 430207)

对于呼吸道病原微生物而言,气溶胶吸入是其感染宿主的重要途径[1-2]。 鉴于非人灵长类动物(non-human primates,NHP)与人类密切的基因相关性,因此在候选疫苗、治疗性药物的临床前研究中,NHP 具有独特而重要的作用[3-9]。 非人灵长类动物口鼻式气溶胶暴露系统可以通过装有细菌、病毒等病原微生物悬浮液的雾化器雾化产生微生物气溶胶,NHP 吸入气溶胶后,在感染过程中避免了消化道、皮肤等其他暴露途径感染,可以模拟呼吸道病原自然感染途径,为致病性病原微生物吸入感染、疫苗气溶胶免疫、肺给药、气溶胶攻毒评价疫苗或药物效果的研究提供了良好的评价技术平台[10]。本研究选择流感病毒作为模式病毒,在生物安全三级实验室中使用非人灵长类动物口鼻式气溶胶暴露系统装置产生病毒气溶胶,评价了病毒气溶胶粒径、气溶胶输出均一性、稳定性、气密性等重要参数,以及装置的消毒效果验证,为将来建立SARSCoV-2 及其它病毒气溶胶感染NHP 模型奠定基础。

1 材料和方法

1.1 实验材料

1.1.1 细胞

MDCK 细胞由武汉生物制品研究所有限责任公司国家联合疫苗工程技术研究中心提供。

1.1.2 病毒株

流感病毒B/Phuket/3073/2013(B/Yamagata lineage)由武汉生物制品研究所有限责任公司国家联合疫苗工程技术研究中心提供。

流感病毒B/Phuket/3073/2013 (B/Yamagata lineage)是WHO 推荐并经国家药品监督管理部门批准的乙型流行性感冒病毒的疫苗株,属于《人间传染的病原微生物名录》中的第三类病原微生物,不属于高致病性病原。 由于其致病性较弱,属囊膜病毒,对消毒剂较敏感,易于在三级生物安全实验室操作,其细胞培养物病毒滴度较高可达108CCID50/mL,可满足实验需要,因此被本研究选作SARS-CoV-2 的代替病毒。

1.2 主要试剂与仪器

DMEM 培养基(美国Gibco 公司);新生牛血清(杭州四季青公司);青链霉素(美国HyClone 公司);TPCK-胰酶(美国Sigma 公司);1%鸡红血球(自制)。

非人灵长类动物口鼻式气溶胶暴露系统(北京慧荣和科技有限公司);TSI 3321 气溶胶粒径分析仪(美国TSI 公司);B2 生物安全柜(苏州安泰空气技术有限公司);二氧化碳培养箱(美国Thermo 公司);汽化过氧化氢灭菌器(杭州美卓生物科技有限公司)。

1.3 实验方法

1.3.1 非人灵长类动物口鼻式气溶胶暴露系统

非人灵长类动物口鼻式气溶胶暴露系统如图1所示,主要由气溶胶发生模块(过滤器、流量控制器、Collison 气溶胶发生器、正交稀释器)、染毒模块(口鼻罩、头罩、猴椅)、分析模块(AGI-30 采样器)、控制模块(调节阀、流量控制器)、废气处理模块(过滤器)组成。 整体采用分布式动态气溶胶口鼻暴露技术。 实验室的洁净压缩空气进入系统后分成两路,一路经过流量控制器后进入气溶胶发生器用于气溶胶发生,然后进入正交稀释器,另一路经过流量控制器后作为稀释气流直接进入正交稀释器。两路气流经过涡旋混合后形成特定浓度的气溶胶进入气溶胶静压腔,并经过顶部的6 路分流管路分别输送到6 个实验猴口鼻罩的进气口处,实验猴吸入后产生的废气经口鼻罩出气口处排出,汇流过滤后经过流量控制器由抽气泵排出。

图1 非人灵长类动物口鼻式气溶胶暴露系统示意图Figure 1 Schematic figure of the oral and nasal aerosol exposure system in non-human primates

1.3.2 流感病毒滴度测定

使用微量细胞病变法进行病毒滴度的测定,胰酶消化MDCK 细胞制备细胞悬液,接种至96 孔细胞培养板中,每毫升2.0×104～3.0×104个,每孔100 μL。 将流感病毒样本10 倍系列梯度稀释后接种至96 孔板中,每个稀释度8 个复孔,33℃二氧化碳培养箱中培养6 d。 观察出现细胞病变的孔数,使用Kaber 法计算病毒滴度。

1.3.3 气溶胶发生参数和采样参数设定

将20 mL 一定浓度的流感病毒加入六孔Collison 气溶胶发生器中,设置气溶胶发生流量为12 L/min,稀释流量为40 L/min,抽气流量为55 L/min,维持头罩负压,气溶胶稳定发生5 min 后使用AGI-30 液体冲击式采样器连接头罩采样口采样,采样溶液为30 mL 的DMEM 培养基,采样流量为10 L/min,采样时间5 min。

1.3.4 气溶胶粒径大小、均一性和稳定性评价

将30 mL 气溶胶发生液加入六孔Collison 气溶胶发生器中,按照1.3.3 设定气溶胶发生参数,分别在静压腔和头罩采样处接入TSI 3321 气溶胶粒径分析仪检测气溶胶总粒子的中值直径,检测时间点分别为气溶胶发生后5、10、20、30 和40 min,评价气溶胶粒径大小、均一性和稳定性。

1.3.5 流感病毒气溶胶达到头罩评价

将20 mL 3.5×106CCID50/mL 流感病毒液加入到六孔Collison 气溶胶发生器中产生气溶胶,将AGI-30 液体冲击式采样器连接至头罩采样口处进行采样,测定样品中流感病毒滴度,评价气溶胶是否能到达供气静压腔和头罩。

1.3.6 流感病毒气溶胶头罩分布均一性评价

非人灵长类动物口鼻式气溶胶暴露系统染毒模块共包含6 个头罩,分别向六孔Collison 气溶胶发生器中分别加入20 mL 低浓度(3.5×106CCID50/mL)和高浓度(7.1×107CCID50/mL)流感病毒液产生气溶胶,并将AGI-30 液体冲击式采样器连接头罩采样口进行采样,测定样品中流感病毒滴度,评价不同病毒浓度的气溶胶发生液产生的气溶胶能否均匀分布达到至6 个头罩。

1.3.7 流感病毒的耐雾化能力评价

向六孔Collison 气溶胶发生器中加入20 mL 7.1×107CCID50/mL 的流感病毒液产生气溶胶,分别在气溶胶发生0、3、5、8、10、15、20、25、30、35 和40 min 时采集发生器中流感病毒样品,测定样品中流感病毒滴度,测定气溶胶发生状态下流感病毒存活率。

1.3.8 气溶胶发生器和采样器中流感病毒浓度的线性关系

将1.3×107CCID50/mL 的流感病毒液10 倍系列梯度稀释,分别取1.3×107CCID50/mL、1.3×106CCID50/mL、1.3×105CCID50/mL、1.3×104CCID50/mL 各20 mL 加入到六孔Collison 气溶胶发生器中产生气溶胶,用AGI-30 液体冲击式采样器采集头罩处的气溶胶样品,测定样品中流感病毒滴度,评价Collison 发生器(Input) 和Impinger 采样器(Output)中流感病毒浓度的线性关系。

1.3.9 装置气密性评价

在1.3.6 中使用高滴度流感病毒作为气溶胶发生液产生气溶胶时,在非人灵长类动物口鼻式气溶胶暴露系统易发泄露的管道连接处(如气溶胶发生器出口、静压腔入口、6 个口鼻罩出口、预实验采样器进口、预实验采样器出口、采样器进气口、采样器出气口)使用拭子涂抹采样30 s,将采样拭子放入2 mL DMEM 培养基中,充分混匀后,加入到生长致密的MDCK 细胞中,33℃二氧化碳培养箱培养72 h,观察是否发生细胞病变,评价装置在运行过程中是否发生气溶胶泄露。

1.3.10 装置消毒效果评价

采用35%过氧化氢及气体发生器分批次对气溶胶暴露系统管道及负压柜腔体进行消毒,使用嗜热脂肪芽孢杆菌菌片(ATCC 7953,菌种浓度为每片5×105～5×106cfu)作为生物指示剂。 消毒前,分别在管道和负压柜腔体布置生物指示剂。 消毒完成后,及时取出指示剂,放入加有0.5%中和剂硫代硫酸钠的溴甲酚紫葡萄糖蛋白胨水培养基中,56℃培养7 d 后进行结果判定。

1.4 统计学方法

本研究数据采用GraphPad Prism 9.0.0 统计分析软件,对结果进行t检验和方差分析,P＜0.05 为差异有统计学意义,P＜0.01 为差异有显著统计学意义,P＜0.001 为差异有极显著统计学意义。

2 结果

2.1 气溶胶粒径大小、均一性和稳定性评价

气溶胶发生后,使用TSI 3321 气溶胶粒径分析仪在不同时间点分别检测静压腔和头罩处的气溶胶总粒子的中值直径,结果如表1 所示,非人灵长类动物口鼻式气溶胶暴露系统产生的气溶胶颗粒中值直径为(1.04±0.03)μm,对应安德森采样器的6 级(0.65～1.1)μm,气溶胶发生后40 min 内,静压腔和头罩处的气溶胶的中值直径的均一性和稳定性良好。

表1 气溶胶粒子中值直径、均一性和稳定性Table 1 Median diameter, uniformity and stability of aerosol particles

2.2 流感病毒气溶胶达到头罩评价

使用AGI-30 冲击式采样器采集静压腔和头罩处的气溶胶,通过微量细胞病变法检测静压腔和头罩处病毒气溶胶浓度,结果如图2 所示,静压腔和头罩中都能检测到一定滴度的流感病毒,表明该装置能正常运行并能产生病毒气溶胶,产生的气溶胶能经静压腔途径管道到达头罩处,且传递过程中气溶胶浓度无显著差异(P＞0.05)。

图2 采样器采集静压腔和头罩处的气溶胶浓度Figure 2 Aerosol concentrations of samplers which collect in the static pressure chamber and the hood

2.3 流感病毒气溶胶头罩分布均一性评价

分别使用低浓度(3.5×106CCID50/mL)和高浓度(7.1×107CCID50/mL)流感病毒进行气溶胶发生,使用AGI-30 冲击式采样器收集6 个头罩气溶胶并进行病毒滴度检测,结果见图3 所示。 实验结果表明同一滴度流感病毒产生的气溶胶在6 个头罩的浓度无显著差异(P＞0.05),说明气溶胶在6 个头罩分布均匀,且气溶胶浓度与发生器病毒滴度有关。

图3 不同头罩处的流感病毒气溶胶浓度Figure 3 Aerosol concentrations of samplers which collect in the six hoods

2.4 流感病毒的耐雾化能力评价

为评价气溶胶发生过程中流感病毒的耐雾化能力,分别检测气溶胶发生3、5、8、10、15,20、25、30、35 和40 min 时气溶胶发生器中流感病毒存活率,见图4。 实验结果表明气溶胶发生0～5 min,流感病毒存活率迅速下降,5～30 min 流感病毒存活率较为稳定,存活率高于50%,30 min 后流感病毒活性继续迅速下降。 根据上述结果,气溶胶发生后5～30 min 可作为NHP 感染的窗口期,约为25 min。

图4 流感病毒的耐雾化能力Figure 4 Atomization resistance of influenza virus

2.5 发生器和采样器中流感病毒气溶胶浓度的线性关系

根据“2.3 流感病毒气溶胶头罩分布均一性评价”实验结果,流感病毒气溶胶浓度和气溶胶发生器中流感病毒滴度有关。 为进一步确定二者之间的关系,在气溶胶发生器中加入不同滴度的流感病毒溶液,检测对应流感病毒气溶胶浓度,结果如图5所示,实验结果表明流感病毒气溶胶浓度与发生器病毒滴度的对数值具有良好的线性关系,标准曲线方程为y=0.8625x-2.4173(R2=0.9989)。

图5 流感病毒Input(Collison)和Output(Impinger)的线性关系Figure 5 Correlation between input (Collison) and output (Impinger) virus titres of influenza virus when aerosolized using the oral and nasal aerosol exposure system for non-human primates

2.6 装置气密性评价

使用拭子在非人灵长类动物口鼻式气溶胶暴露系统中病毒气溶胶易发生泄露部位(气溶胶发生器出口、静压腔入口、6 个头罩出口、预实验采样器进口、预实验采样器出口、采样器进气口和采样器出气口)涂抹采样,将采集样本接种到MDCK 细胞中,培养后12 个采样点样本接种的细胞均未发生病变。 提示非人灵长类动物口鼻式气溶胶暴露系统在气溶胶发生过程中未发生气溶胶泄露,装置气密性良好。

2.7 装置消毒效果评价

嗜热脂肪芽孢杆菌生物指示剂培养7 d 后,对指示剂逐支进行检查,实验组接种生物指示剂的培养基均未变色(呈现紫色),阳性对照培养基颜色变色(紫色变黄色),阴性对照培养基未变色(呈现紫色)。 实验结果表明使用35%过氧化氢采用汽化方式对非人灵长类动物口鼻式气溶胶暴露系统可以进行有效地消毒,消毒效果完全。

3 讨论

非人灵长类动物口鼻式气溶胶暴露系统能正常运行,产生具有感染性的气溶胶颗粒,气溶胶颗粒的中值直径为(1.04±0.03)μm,颗粒大小可直接进入肺泡。

在气溶胶暴露感染实验动物时,基于动物的氧气消耗,推荐气溶胶气体流量为每分钟呼吸体积的1.5 倍,使用动物呼吸量2.5～4 倍的气溶胶气体流量可将气溶胶浓度保持在目标浓度的90%[11]。 2～4 岁恒河猴呼吸量为1.5～3.8 L/min[12]。 美国陆军传染病医学研究所和匹兹堡大学疫苗研究中心进行不同种类的NHP 气溶胶暴露感染时,提供给每只NHP 的气体流量为7.5 L/min 左右[13-14]。 本系统装置可同时进行6 只NHP 的气溶胶暴露感染,在本研究中使用6 孔Collison 气溶胶发生器,将气溶胶流量设为12 L/min,稀释流量设为40 L/min,提供给每只试验猴的气溶胶气体流量为8.7 L/min 左右,为恒河猴呼吸量的2.3～5.8 倍,同时本生物安全三级实验室前期进行恒河猴适应性模拟气溶胶感染时,采用此染毒程序参数进行气溶胶感染,恒河猴在整个20 min 感染过程中呼吸均匀状态良好。

Collison 气溶胶发生器使用压缩空气使液体雾化产生气溶胶颗粒,雾化过程由于剪切力、撞击力、浓缩作用等的影响,会导致部分微生物衰亡或失去活性[15];同时AGI-30 液体撞击式采样器在采样过程中存在微生物粒子撞击时的损伤、逃逸及再次气溶胶化等问题[16],因此本研究中采集到的气溶胶中流感病毒滴度比气溶胶发生液中滴度低2.4 log10CCID50。 采用Collison 发生器(Input)发生SARSCoV-2 气溶胶或东方马脑炎病毒,采用AGI-30 液体撞击式采样器(Output)采集病毒气溶胶,Input 和Output 病毒滴度之间具有良好的线性关系,分别损失2 log10pfu[17]和3.4 log10pfu[18],这与本研究的实验结果相一致。

本研究中,在气溶胶发生30 min 内,Collison 气溶胶发生器中流感病毒的存活率高于50%,这与噬菌体D29 的存活率基本相符[19],Mainelis 等[20]也报道了荧光假单胞菌经Collison 气溶胶发生器雾化90 min 后,活力损伤了50%,然而Hermann 等[21]指出病毒在机械上比细菌更容易雾化,Ibrahim 等[22]研究显示用Collison 气溶胶发生器连续雾化60 min 的过程中,H1N1 流感病毒活力出现轻微的损失,Kim等[23]报道有囊膜的冠状病毒在雾化30 min 后,病毒存活率仅下降了15%。 高致病性禽流感、SARSCoV-2、尼帕病毒、埃博拉病毒等重大呼吸道病毒性传染病有可能通过气溶胶传播,SARS-CoV-2 气溶胶吸入暴露剂量在3.7～4.2 log10pfu 可以感染非洲绿猴[17],2.6～4.7 log10pfu 的埃博拉病毒可以通过气溶胶感染恒河猴[24],2.0～3.0 log10pfu 的尼帕病毒可以通过气溶胶感染非洲绿猴[25],这些呼吸道病毒对NHP 的气溶胶暴露剂量在2.0～4.7 log10pfu 即可成功建立感染模型,因此尽管本研究中使用的我国自主研发的气溶胶暴露系统在气溶胶发生过程中流感病毒存活率方面与先进国际水平相比仍然存在较大差距,但若使用高浓度(107CCID50/mL 以上)病毒发生液产生气溶胶时,在5～30 min 的感染窗口期内,实验猴吸入气溶胶10～20 min,可以达到104CCID50左右的感染剂量,理论上可以成功建立病毒气溶胶NHP 感染模型。

使用高浓度流感病毒液产生气溶胶进行装置气密性测试评价时,未检测到具有感染性的流感病毒,表明该暴露装置没有发生气溶胶泄露,对生物安全三级实验室保护良好。 嗜热脂肪芽孢杆菌对各种消毒方式具有较强的抵抗力,可以作为消毒效果验证的直接指标[26]。 以嗜热脂肪芽孢杆菌作为消毒指示菌的效果验证,表明使用35%过氧化氢采用汽化方式可对该系统进行有效地消毒,消毒效果完全。

综上所述,本研究在生物安全三级实验室中以流感病毒评价了非人灵长类动物口鼻式气溶胶暴露系统运行中病毒气溶胶的重要参数,包括气溶胶粒径、气溶胶输出气密性、均一性、稳定性等。 这些广泛的基础性数据使我们能够对非人灵长类动物口鼻式气溶胶暴露系统的基本情况有客观深入的认识,并为有效地利用这一系统建立SARA-CoV-2和其它病毒气溶胶感染NHP 模型提供了可能。