邓 伟金亮子奎秀莹王文广李 娜仝品芬代解杰*

(1.中国医学科学院/北京协和医学院 医学生物学研究所,昆明 650031;2.云南大学生命科学学院,昆明 650091;3.昆明医科大学,昆明 650500)

寨卡病毒(Zika virus,Zikv)为单股正链RNA 病毒,属于黄病毒的一种,研究表明Zikv 感染可导致睾丸发生炎症,引起睾丸内部结构受损及细胞大量死亡[1],对男性生殖健康带来潜在威胁。 研究发现Zikv 感染可导致小鼠睾丸间质充血、睾酮水平下降、睾丸间质细胞(Leydig cells,LCs)产生大量炎症因子及趋化因子,说明LCs 与Zikv 感染睾丸密切相关,但具体感染机制尚不明确。

LCs 主要分布于生精小管之间,是睾丸主要细胞类型之一[2],在毒理学、药理学及生殖遗传学等研究方面具有十分重要的应用意义,是睾丸中唯一能够分泌睾酮的细胞[3],可促进精子的发生和男性生殖器官发育,以及维持第二性征和性功能,大约95%的雄性激素由其分泌[4]。 研究发现LCs 数量缺少会导致雄性激素缺乏[5],体外分离培养纯度高、活性强的LCs 可更好的研究其相关机制和特性。

LCs 占睾丸细胞总数的2%～4%[6],数量较少且纯化难度较大,目前对于LCs 的分离培养主要有机械分离法[7]、组织块贴壁法[8]、酶消化法[9]、percoll 密度梯度离心法[10]等几种方法,机械分离法对细胞损伤较大,组织块贴壁法杂细胞太多且周期较长,percoll 密度梯度离心法得到的细胞仍存在其他杂细胞,并且采用单一方法难以实现LCs 分离培养。

树鼩(Tupaiabelangeri,tree shrew)在生理、生化、新陈代谢、解剖结构以及基因组[11]等生物学特性比啮齿类更接近于非人灵长类,已广泛应用于人类疾病模型的研究,包括病毒感染模型[12]、肿瘤模型[13]、呼吸系统疾病模型[14]和神经系统疾病模型[15]等。 本文旨在参考其他动物LCs 培养与纯化方法的基础上,采用酶消化、percoll 密度梯度离心及差异贴壁等分离纯化方式结合,建立树鼩LCs 原代培养和纯化方法,为利用树鼩开展相关研究提供新的实验材料;通过Zikv 对LCs 的感染特性研究,建立Zikv 感染的睾丸细胞模型,为研究Zikv 感染雄性生殖系统的相关研究提供实验基础。

1 材料和方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物

2 只3 月龄普通级雄性滇西亚种树鼩,体重95～110 g,由中国医学科学院医学生物学研究所树鼩种质资源中心饲养繁殖[SCXK(滇)K2018-0002];所有实验均在中国医学科学院医学生物学研究所树鼩种质资源中心进行[SYXK(滇)K2018-0002],本实验经中国医学科学院医学生物学研究所审批(DWSP202008014),并遵循实验动物使用的3R 和福利伦理原则。

1.1.2 病毒株

Zikv GZ01 株,由军事医学科学院秦成峰教授馈赠。

1.2 主要试剂与仪器

DMEM/F12 培养基(Gibco 公司);胎牛血清(FBS,以色列Biological Industries);IV 型胶原酶(北京索莱宝);PBS(美国Hyclone);0.25% trypsin-EDTA胰蛋白酶、青-链霉素(美国Gibco);无血清冻存液(美国Cyagen);Testosterone ELISA kit(上海碧云天);3β-HSD 小鼠单克隆IgG 抗体(Santacruz);荧光标记的羊抗鼠IgG(英国Abcam);病毒RNA 提取试剂盒QIAamp ® Viral RNA Mini Kit(德国Qiagen);One Step Prime Script TM RT-PCR Kit(日本TaKaRa)。 生物安全柜和CO2恒温培养箱(美国Forma);台式高速离心机(美国Beckman);细胞计数仪(美国Bio-Rad);倒置荧光相差显微镜(日本Nikon)。

1.3 实验方法

1.3.1 树鼩LCs 分离、纯化

取3 月龄的雄性树鼩,腹腔注射0.4 mL 3%戊巴比妥钠麻醉处死后,无菌取出睾丸,75%乙醇中浸泡20 s,取出后用PBS 冲洗两遍去乙醇。 移入Heraguard ECO 超净工作台,用眼科剪和镊子去除睾丸的白膜、附睾及血管,小心取出睾丸实质组织,置于装有D-Hanks 液的无菌培养皿中,洗涤2 遍。用眼科剪将其剪碎后转入离心管内。 加入1 mg/mL IV 胶原酶,放入37℃、5% CO2培养箱孵育30 min,1000 r/min 离心5 min,加入0.25%胰酶消化10 min后,用含血清的培养基终止消化,吸管吹打混匀,将细胞悬液放入40 目细胞筛网中过滤,使之分散成单个细胞。 收集到15 mL 离心管中,1000 r/min 离心5 min,弃上清,加入DMEM/F12 培养液重悬细胞,重复离心1 次。

纯化方法采用percoll 密度梯度离心法[16]:将分离得到的细胞悬液加于不同密度梯度的Percoll 分离液上,从分离管底部向上密度依次为60%、37%、26%、21%,4℃、3000 r/min 离心30 min。 收集37%和60%之间的细胞,后用DMEM/F12 培养液稀释,再将悬液以1500 r/min 离心10 min,沉淀加入含胎牛血清的培养液,摇匀得细胞悬液。 将分离纯化得到的细胞悬液计数,后稀释成每毫升1×106个浓度的细胞悬液,接种于培养瓶或培养板中37℃,5%CO2培养箱中培养,培养基配方为DMEM/F12 培养基加10% FBS、1%青-链霉素。 此时细胞中还含有少量支持细胞和其他杂细胞,根据间质细胞和支持细胞贴壁时间不同,在传代后6 h 更换培养液以去除杂细胞达到纯化目的,第2 代和第3 代的细胞仍按此步骤进一步纯化。

1.3.2 树鼩LCs 免疫荧光鉴定

间质细胞鉴定采用3β-羟类固醇脱氢酶(3β-HSD)鉴定法[17]。 将纯化后的第3 代细胞接种在24孔板中,待细胞长满70%～80%时,吸去培养基,PBS洗3 次,每次3 min,加入4%多聚甲醛固定20 min,PBS 清洗3 次,每次3 min,加入0.5% Triton X-100室温孵育20 min,PBS 清洗3 次,每次3 min;5%山羊血清封闭30 min,PBS 清洗3 次,每次3 min,加入稀释好的鼠源性3β-HSD 一抗(稀释比例1 ∶50),同时设置对照孔(加PBS),4℃孵育过夜,将孔板用PBS 清洗3 次,每次3 min;避光条件下加入羊抗鼠荧光二抗(1 ∶400)室温孵育1 h,PBS 清洗3 次,每次3 min;加入DAPI 染色液孵育2 min,PBS 清洗3次,每次3 min,置于荧光显微镜下拍照观察。

1.3.3 树鼩LCs 增殖曲线测定

将纯化后的第3 代LCs 消化成细胞悬液,按每孔1×105个接种于48 孔板,设置1～7 d 共7 个组,每组设置2 个副孔,从接种时间起每隔24 h 吸去培养液并消化计数,取平均值,以培养时间为横坐标、细胞密度为纵坐标绘制增殖曲线。

1.3.4 树鼩LCs 分泌睾酮水平测定

采用Testosterone ELISA kit 检测睾酮水平,将培养第4 代至第7 代的LCs 按1×105个每孔接种于12 孔板的培养皿上,之后每24 h 更换培养液,分别在培养 24、48 h 后收取培养液,每个时间点收取3个样本测定睾酮含量,取平均值。

1.3.5 寨卡病毒感染实验

将对数生长期的第3 代树鼩LCs 用0.25%胰蛋白酶消化重悬,以密度为每毫升1×105个每孔接种于24 孔板内,24 h 后将寨卡病毒(滴度1×106copies/mL)以MOI=1 感染细胞,在感染后2、6、12、24、36、48、72 和96 h 时间点收集细胞和上清液,QIAamp®Viral RNA Mini Kit 试剂盒提取核酸,RTqPCR 检测病毒载量,显微镜下观察细胞形态变化,并以对寨卡病毒易感的Vero 细胞按相同步骤作对比实验。

感染细胞后睾酮水平测定:以上述方法感染细胞2 h 后,PBS 洗掉未吸附的病毒,添加1 mL 细胞培养液,分别在12、24、36、48 h 收集感染组和对照组培养液(不同时间段感染组和对照组样品收集均为相应的同一个孔,每个时间点收取3 个样本),同时补加1 mL 培养液,竞争法酶联免疫吸附测定检测睾酮水平,取平均值。

1.4 统计学方法

采用SPSS 17.0 统计学软件进行数据处理。 数据用平均数±标准差(±s)表示,采用两两独立样本的t检验分析。P＜0.05 表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 树鼩LCs 形态学观察和鉴定

经percoll 密度梯度离心分离后的细胞6 h 后开始贴壁,呈不规则的形态,培养至第3 天后细胞开始长出触角(图1A),培养至7 d 进行第1 次传代,待传代细胞培养6 h 后换液,去除未贴壁的杂细胞;传至第3 代后细胞活性开始增高,能够快速增殖,细胞呈典型的拉网状(图1B),之后根据密度1 ∶3～5 传代即可。 传至第6 代后,细胞形态略微有点变化,细胞长度稍微变短,宽度增加,但仍有触角伸出(图1C)。 随着细胞数量的增多,细胞间的界限和触角不在明显,从无序状变为纹理状(图1D),细胞可稳定传至15 代以上。

细胞鉴定:3β-羟类固醇脱氢酶是睾酮合成的关键酶之一,是公认的LCs 鉴定指标。 3β-HSD 免疫荧光鉴定显示,细胞均为阳性表达,证明所分离培养的细胞为LCs,且细胞纯度高达98%以上,见图2。

图2 树鼩睾丸间质细胞3β-HSD 免疫荧光鉴定Note. 3β-HSD, 3β-hydroxysteroid dehydrogenase. DAPI, 4’, 6-diamidino-2-phenylindole. Merge, Combination of 3β-HSD and DAPI.Figure 2 3β-HSD lmmunofluorescence ldentification of Leydig cells in tree shrew

2.2 树鼩LCs 增殖曲线的测定

睾丸间质细胞生长曲线结果显示,在培养前3 d增殖迅速,活力较强,为对数增长期,3～5 d 为增殖平台期。 提示可选择第3 天的细胞进行后续实验,见图3。

图3 树鼩睾丸间质细胞增殖曲线Note. Number of cells on days 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6 and 7 after LCs inoculation.Figure 3 Tree shrew testicular Leydig cells proliferation curve

2.3 树鼩LCs 分泌睾酮活性检测

酶联免疫吸附测定法检测结果显示,第4 代至第7 代的LCs 在培养48 h 内能够分泌睾酮,分泌量在1.1～1.3 ng/mL 左右,说明分离的LCs 具有持续分泌睾酮的能力,见图4。

图4 不同代次树鼩睾丸间质细胞睾酮分泌能力测定Note. P4, P5, P6, and P7 represent the 4th, 5th, 6th and 7th generations of tree shrew LCs, respectively. Comparison of testosterone secretion in 0～24 h and 24～48 h from the 4st generation to the 7th generation LCs.Figure 4 Determination of testosterone secretion capacity of tree shrew LCs at different passages

2.4 树鼩LCs 感染寨卡病毒后形态学观察

感染结果表明,36 h 时LCs 已经大量病变,96 h 几乎观察不到活细胞,而96 h 时对照组细胞形态正常;Vero 细胞在感染96 h 后才能观察到轻微的细胞病变,初步说明LCs 比Vero 更易感染Zikv,见图5。

图5 寨卡感染树鼩睾丸间质细胞和Vero 细胞后形态学观察Note. A, LCs were infected with Zikv for 36 h. B, LCs infected for 96 h. C, LCs 96 h control group. D, Vero infected with Zikv for 36 h. E,Vero infection 96 h. F, Vero 96 h control group.Figure 5 Morphological observation of testicular Leydig cells and Vero cells in tree shrews infected by Zikv

2.5 细胞和上清液病毒载量测定

RT-qPCR 结果表明,感染2 h 后LCs 细胞中病毒载量可达1.93×105copies/mL,且6 h 内持续上升达到峰值2.15×105copies/mL,36 h 后由于细胞死亡裂解病毒载量逐渐下降,细胞上清液中病毒载量在感染12 h 后迅速上升,在48 h 后达到峰值1.3×105copies/mL;Vero 细胞在感染36 h 后细胞中病毒载量才开始增加,到96 h 病毒载量仍在上升,但病毒拷贝数小于同期的LCs,表明Zikv 能够在LCs 中迅速增殖并释放出子代病毒,见图6。

图6 寨卡病毒感染睾丸间质细胞和Vero细胞后病毒增殖曲线Note. Viral loads in cells and supernatants of LCs and Vero at 2, 6, 12,24, 36, 48, 72 and 96 h after infection with Zikv.Figure 6 Virus proliferation curve after Zikv infection of testicular Leydig cells and Vero cells

2.6 Zikv 感染树鼩睾丸间质细胞睾酮分泌能力测定

ELISA 睾酮水平测定结果显示,正常培养的LCs 在前36 h 内,其睾酮分泌量为1.168～1.352 ng/mL,而感染寨卡病毒36 h 内细胞睾酮分泌量为1.051～1.156 ng/mL,略低于正常培养的细胞,并且在感染36～48 h 内睾酮分泌量下降到0.122 ng/mL,而正常培养的细胞仍然具有正常分泌睾酮的能力,分泌量为1.133 ng/mL。 并且细胞数量测定结果显示,感染组和对照组的的活细胞数量在测定时间内无显著差异,表明Zikv 感染树鼩LCs 能够使其睾酮分泌能力下降甚至缺失,见图7、8。

图7 感染组与对照组活细胞数量的测定Note. Comparison of the number of viable cells of LCs with the normal control group at 12, 24, 36 and 48 h after infection with Zikv.Figure 7 Determination of the number of viable cells in the infected group and the control group

图8 细胞感染后睾酮水平测定Note. Comparison of tes tosterone secretion content of LCs at 0～12, 12～24, 24～36, 36～48 h after infection with Zikv.Compared with the normal control group, *P＜0.05.Figure 8 Determination of testosterone levels after cell infection

3 讨论

Zikv 不仅能够感染神经系统,研究表明睾丸也是Zikv 感染的主要靶器官,Zikv 病毒能够在睾丸中大量增殖和复制,引起睾丸结构破坏及大量细胞死亡,从而导致雄性性功能受损。 本实验利用分离培养的树鼩LCs 作为Zikv 感染的细胞模型,研究其感染特性,为探讨Zikv 入侵雄性生殖系统的作用机制提供基础。

树鼩睾丸中LCs 的数量稀少,其分离纯化方法尤为关键。 实验使用3～4 月龄的树鼩作为实验材料,这段时期正处于树鼩的青春期,细胞活力旺盛,具备良好的睾酮分泌能力;其次,此时树鼩的睾丸白膜,血管易分离,能有效去除原代培养中成纤维细胞和血管内皮细胞污染,更容易成功分离细胞。

传统的percoll 密度梯度法虽然能够去除大部分杂细胞,但仍然有支持细胞存在,本研究多次实验发现在支持细胞和LCs 共同培养时,支持细胞为优势细胞,单一的percoll 密度梯度法虽然能够成功得到大部分LCs,但培养后期纯度逐渐降低,差异贴壁法能够有效去除杂细胞而达到进一步纯化目的。本实验通过percoll 密度梯度离心得到较为纯化的LCs,根据LCs 和支持细胞的贴壁速率不同,睾丸间质细胞先贴壁[18],待原代细胞培养6～7 d 时可进行第1 次差速贴壁纯化,在传代6 h 后换一次液去除还没贴壁的细胞,按此操作传至第3 代后基本无杂细胞,并且活力旺盛,增殖迅速,3β-HSD 免疫荧光鉴定细胞结果表明纯度高达98%。 此外,酶联免疫吸附测定结果表明所得到的LCs 具备连续分泌睾酮能力,与Risberidge 等[19]报道的结果一致。

本实验结合Percoll 密度梯度离心和差速贴壁法对LCs 进行纯化,此方法与传统的Percoll 密度梯度纯化方法相比更能达到纯化目的,有效去除了杂细胞,使LCs 在培养过程有效避免了优势贴壁细胞(支持细胞)的排挤,实现了LCs 的长期培养;培养基采用DMEM/F12 培养基加10% FBS、1%青-链霉素,该培养基配制方法简单,与传统的LCs 培养基相比无需添加生长因子及其他成分,节约了培养时间和成本。

临床资料表明Zikv 可感染男性生殖系统中的多个器官并长期潜伏,其中睾丸是主要的靶器官,有研究人员曾以人类睾丸组织进行Zikv 感染实验,但因多方面原因导致该项研究失败。 目前用于Zikv研究的动物模型主要有小鼠、鸡胚、恒河猴、树鼩等,鸡胚与人类结构相差甚远,恒河猴是较为理想的实验动物,但在恒河猴感染Zikv 的研究主要集中于神经系统方面,当前关于Zikv 感染睾丸的研究主要以小鼠为主,但小鼠大多需要干扰素拮抗处理后才能成功感染Zikv。 研究表明树鼩对Zikv 易感,且不需要拮抗处理,在Zikv 感染树鼩的研究中发现病毒能够在睾丸中大量复制,免疫组化实验结果表明Zikv 主要集中在LCs[20],但未进一步在细胞水平上进行验证。

多项研究表明LCs 是Zikv 感染的主要靶细胞[21],Zikv 感染免疫缺陷型小鼠可导致雄性小鼠睾丸萎缩、LCs 数量减少、睾酮水平及与睾酮产生相关的基因表达水平下降,阻碍精子成熟、睾丸萎缩;Zikv 也能够在体外培养的小鼠LCs 中高效复制。 本实验首次使用Zikv 感染树鼩LCs,发现6 h 内病毒迅速增殖和复制,36 h 后细胞开始大量死亡,证明树鼩LCs 对Zikv 易感;ELISA 结果表明感染后能导致LCs 睾酮分泌能力下降甚至缺失。 这些实验结果与已报道的Zikv 感染睾丸的研究结论相辅证,提示Zikv 感染LCs 可能是引起睾丸损伤及不育的主要原因之一,表明树鼩LCs 可作为Zikv 感染的体外细胞模型。

综上所述,本实验采用两步酶消化、percoll 密度梯度离心结合差速贴壁法能够获得产量高、活性强、可连续传代和稳定增殖的树鼩LCs,为树鼩LCs体外分离培养进行了实验性探索,成功建立树鼩LCs 体外分离培养方法;并利用寨卡病毒感染树鼩LCs,定量检测病毒增殖情况和睾酮分泌水平,证明Zikv 可成功感染树鼩LCs,可建立寨卡病毒感染树鼩间质细胞模型,为寨卡病毒感染导致雄性睾丸损伤及不育的致病机制提供研究基础。