范仕郡吴 丹夏 林魏 燕陈 倩彭 曦

(陆军军医大学第一附属医院临床医学研究中心,重庆 400038)

烧伤是由高温、化学物质或电引起的组织损伤。 其严重程度主要与烧伤深度、面积、伤前疾病、合并伤有关。 患者还可能伴随系列严重并发症如休克、吸入性损伤、感染、多器官功能障碍、应激性溃疡等[1]。 感染是烧伤患者的常见并发症,一旦进展为全身性感染,极易引发全身性炎症反应和脏器功能障碍,导致烧伤脓毒症的发生,致死率居高不下[2]。 烧伤患者可经多种途径引发全身感染,其中又以经皮肤创面感染为最主要的途径。 烧伤直接破坏皮肤的完整性,打破了局部组织炎症和免疫平衡,因而极易发生皮肤创面感染,并导致创面脓毒症的发生[3-6]。 自1962 年Teplitz 等[7]首次提出该概念以来,烧伤创面脓毒症作为烧伤特有的脓毒症,一直是烧伤研究领域的核心和热点问题。

建立稳定、可靠且贴近临床病情的动物模型,是研究疾病发生发展和评价治疗手段的重要依托。常规的烧伤模型或脓毒症模型仅能部分模拟烧伤脓毒症的病理生理特点。 烧伤创面脓毒症模型则是在上述基本模型的基础上,通过制作深度烧伤模型造成创面局部组织损伤,并在伤后一定时间内通过涂布或注射等方式接种细菌,造成重度的创面感染,在模型动物中诱导创面脓毒症的发生[8-9]。 该模型既保留了烧伤本身的致伤作用,又通过引入创面感染并造成脓毒症发病,较好的模拟了烧伤创面脓毒症的病理生理过程[10]。

尽管烧伤创面脓毒症模型已得到广泛应用,但已有研究往往关注特点的病理生理改变或疗效指标,而缺乏对模型本身的规范化和标准化操作的研究,对于反映烧伤脓毒症的动态变化特点和发生发展规律等指标的关注也较少。 为此,本研究旨在建立一种操作简便可控、严重程度适宜的创面脓毒症模型,符合烧伤脓毒症的病理生理特点,为脓毒症发病机制和防治研究提供了有意义的基础数据。同时为开展不同程度的创面脓毒症的机制研究、临床药物研发、临床治疗等提供一种标准化动物模型的有效探索路径。

1 材料和方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物

健康SPF 级BALB/c 雄性小鼠135 只(体重22～24 g),购自北京华阜康生物科技股份有限公司[SCXK(京)2019-0008]。 饲养于陆军军医大学第一附属医院实验动物中心[SYXK(渝)2017-0011],饲养于万级屏障环境(温度:22℃～24℃;湿度:50%～60%;饲料为钴60 辐照实验鼠维持饲料;饮水为纯净水)。 本课题经第三军医大学实验动物福利伦理委员会审核批准(AMUWEC20191840),符合3R原则。

1.1.2 菌株

铜绿假单胞菌(ATCC 27853)。

1.2 主要试剂与仪器

异氟烷(瑞沃德生命科技有限公司,批号:217181101);生理盐水(四川科伦药业股份有限公司, 批号: M18082105 - 2 ); TNA-α 试剂盒( Invitrogen, LOT227846 - 005); IL-6 试剂盒( Invitrogen, LOT218546 - 001 )。 保 温 箱(LyonTechno,EWIDE);水浴锅(上海瑞稳仪器设备厂,DK-8AD);电子天平(sartorius,QUINTIX2102-1CN);小动物麻醉机(MATRX,VMR);动物全自动生化仪(Beckman Coulter,AU480)。

1.3 实验方法

1.3.1 模型制备方法

(1)假烫伤组10 只(以下简称S 组)

小鼠吸入麻醉后,小鼠背部备皮脱毛后放入自制烫伤模具。 将背部侵入37℃水面接触8 s(接触面积约15%)。 后转入IVC 笼具继续饲养观察。

(2)烧伤+铜绿假单胞菌125 只(以下简称Sepsis 组)

小鼠吸入麻醉后,小鼠背部备皮脱毛后放入自制烫伤模具。 将背部侵入90℃水面接触8 s(烫伤深度:Ⅲ度,烫伤面积约15%)。 按50 mL/kg 体积腹腔补液后放入30℃保温箱保温。 2 h 后痂下注射100 μL 铜绿假单胞菌(PA)0.75×105CFU/mL,造成烧伤脓毒症模型。 48 h 后转入IVC 笼具继续饲养观察。

1.3.2 存活率观察、体重称量、动物状态评分、采食量记录

实验中每12 h 记录一次各组动物存活情况;每日定时称量小鼠的体重及每组剩余饲料重量,同时为动物状态评分,评价指标共6 项(1～5 分/项)。分别是外观及被毛(竖毛、脱毛、耳壳曲折、口腔有无流涎、肛门处有无腹泻/血便/脱肛)、活动状况(自主活动频率、步态)、神经反应(震颤,痉挛)、呼吸状态(呼吸频率、深浅的异常)、精神反应(精神是否活泼,外界反应是否正常)、姿势和步态(立、卧、坐的姿势有无异常)。

1.3.3 检测指标

模型建立完成后分别在1、2、3、5、7 d 五个时相点取外周血及肝,每个时相点取5 只。

(1)血液取材

血液标本取材:小鼠吸入麻醉后仰卧位。 用碘伏消毒胸部区域后眼科剪剪开表皮,使用1 mL 一次性注射器行心尖无菌采血。

(2)病理取材

病理标本取材:碘伏消腹部区域。 眼科剪剪开腹部后,取肝放入组织固定液中。 经组织脱水、石蜡包埋处理制作石蜡标本切片,HE 染色后在光学显微镜下观察组织病变情况。

1.3.4 检测方法

血清炎症因子采用ELISA 法检测,具体操作按照TNA-α 和IL-6 试剂盒检测说明书。 血清生化采用动物全自动生化仪检测。

1.4 统计学方法

2 结果

2.1 死亡率

建模12 d 内死亡率为30.2%,其中第2～6 天死亡率为27.9%,第7～12 天死亡率为2.3%,说明该模型死亡情况符合脓毒症模型的发病规律。

2.2 平均采食量

S 组与Sepsis 组的平均采食量见图1,可见Sepsis 组在实验后的采食量呈先下降后上升的趋势,至第4 天开始逐渐上升,至第12 天达到S 组平均采食量。

图1 两组平均采食量情况Note. Compared with the S group, the food consumption in the sepsis group decreased rapidly and then restored slowly.Figure 1 Average food intake in two groups

2.3 动物状态评分

S 组与Sepsis 组的状态评分见图2,Sepsis 组在实验后的状态逐步变差,主要表现为眼睛分泌物增多、竖毛、弓背、活动度降低等。 至第5 天开始逐步恢复,至第12 天接近对照组。

图2 两组动物状态情况Note. Compared with the S group, the status of animals in the sepsis group became deteriorated quickly and then recovered gradually approaching to the normal status.Figure 2 Animal status in two groups

2.4 体重变化

S 组与Sepsis 组的体重变化见图3,可见Sepsis组在实验后的体重逐步下降,至第5 天下降至最低日趋稳定,一周后体重开始缓慢上升,至第12 天仍低于对照组。 说明该模型的高代谢、高消耗特征。

图3 两组动物体重情况Note. Compared with the S group, the weight of mice in the sepsis group was quickly reduced and then recovered slowly.Figure 3 Animal weight in two groups

2.5 建模前后小鼠创面变化情况

建模前后小鼠创面情况如图4 所示,假烫伤组小鼠创面均无明显变化;烫伤后24 h 小鼠创面呈痂状,创面干燥,表层组织变厚,创周略红肿无渗出液,皮温稍低。 痂下给菌后24 h 创面整体呈黄绿色,中心及周边出现部分溃疡呈红褐色,出现出血点或坏死斑。 创周有少量分泌物,皮温偏高。 创面周围略肿胀。 小鼠活动明显减少,对外界刺激反应迟钝,走路呈蜷缩弓背状。

图4 建模前后小鼠创面变化情况Note. A, Sham burn group. B, Post burn. C, After PA inoculation.Figure 4 Changes of wound surface conditions in mice before and after model establishment

2.6 炎症因子(TNF-α、IL-6)

炎症因子如图5,TNF-α 在第1 天升至最高值后呈递减趋势,至第3 天恢复至正常。 与S 组相比,Sepsis 组第1、2 天表达明显升高,差异具有统计学意义(P＜0.01,P＜0.05);IL-6 第1 天升至最高值后呈递减趋势,至第7 天恢复至正常。 与S 组相比,Sepsis 组第1、2 天表达明显升高,差异具有统计学意义(P＜0.01)。

图5 不同时相点TNF-α、IL-6 的表达与S 组比较Note. Compared with the S group, *P＜0.05, **P＜0.01.Figure 5 Comparison of TNF-α, IL-6 with S group at different time points

2.7 肝功

如图6 所示Sepsis 组TBIL、TP 在第1、2、3、5、7天与S 组比较均无显著差异;Sepsis 组AST 在第5天升至最高值后呈递减趋势,与S 组相比,AST 在第1、2、3、5、7 天均明显升高,差异具有统计学意义(P＜0.01 或P＜0.05);ALT 在第3 天升至最高值后呈递减趋势,且与S 组相比差异具有统计学意义(P＜0.01)。

图6 不同时相点肝功与S 组比较Note. Compared with the S group, *P＜0.05, **P＜0.01.Figure 6 Comparison of liver function with the S group at different time points

2.8 肾功

如图7 所示Sepsis 组CREA 在第3 天升至最高值后呈递减趋势,与S 组相比,CREA 在第1、2、3、5、7 天均明显升高,差异具有统计学意义(P＜0.01 或P＜0.05);同时UREA 在第3 天升至最高值后呈递减趋势,与S 组相比,第1、2、3、5、7 天均明显升高,差异均具有统计学意义(P＜0.01)。

图7 不同时相点肾功与S 组比较Note. Compared with the S group, *P＜0.05, **P＜0.01.Figure 7 Comparison of renal function with the S group at different time points

2.9 肝病理

肝HE 染色结果如图8 所示,S 组小鼠肝细胞未见变形和坏死,肝窦清晰,未见炎症浸润。 Sepsis 组小鼠肝织在各个时相点均可见炎性细胞浸润、肝细胞水肿和部分坏死。 且第2、3、5 天肝部分面积结构紊乱,中央静脉存在变形,并伴有充血。 肝切片病理显示,第2、3、5 天肝损伤程度明显高于第1 天和第7 天。

图8 不同时相点肝HE 染色与S 组比较Note. A, S group. B, C, D, E and F, Sepsis group at 1,2,3,5,7 days.Figure 8 Comparison of HE staining in liver with the S group at different time points

3 讨论

规范化操作流程的建立是确保实验动物模型稳定稳定可靠的关键。 为此,本研究以BALB/c 小鼠这一广泛使用的小鼠品种作为研究对象,结合既往制作轻中度烫伤模型(15%,Ⅲ度)的工作基础,进一步对痂下接种铜绿假单胞菌的剂量和接种方法等进行摸索,主要经验要点如下:第一,为避免烫伤后小鼠早伤后早期因发生休克导致死亡,进而对后续实验产生干扰,在烫伤后我们对小鼠采取快速保温、液体复苏等模拟临床的综合治疗措施,保证模型小鼠均可稳定顺利度过烧烫伤早期休克期[11-14]。 第二,我们对痂下接种铜绿假单胞菌的方法进行了标化和规范,如细菌培养条件(温度、转速时间)及痂下接种位置(创面中心)进行了统一。 流行病学资料显示,导致创面脓毒症的常见致病菌为金葡菌、铜绿假单胞菌和大肠埃希菌等[15],其中铜绿假单胞菌既是创面感染的常见菌种[16],又在脓毒症继发性感染中具有重要意义[17],因而在建模中应用最为广泛。

第三,经多次实验结果证实,模型动物的12 d死亡率也稳定在30%～40%以内,表明此方法具有良好的可操作性,既保证死亡率符合重度脓毒症动物模型的相关标准,同时也避免了因死亡率过高或过低造成模型指标的波动。 本研究结合前期相关报道,进一步对小鼠烧伤创面脓毒症模型的规范化建模方法进行了探索,建立了标准化操作方法。

为进一步评价模型小鼠在建模后的病理生理变化规律,我们对假烫伤组和烫伤合并细菌感染组小鼠进行了包括基本生理状态和脓毒症相关指标在内的综合性对比研究。 首先,既往较少有研究关注模型小鼠的基本状态,我们在本研究中采用长时相点观测动物体重、采食量、动物状态等指标[18-20],结果显示模型组小鼠以上指标在建模后均长时间低于对照组,虽然进食量在伤后1 d 即开始缓慢上升,但体重和状态在7 d 之前一直持续下降,提示烫伤和感染均造成模型小鼠长期处于高代谢、高消耗状态。 伤后7 d 后,虽然进食量仍未恢复到伤前水平,但因模型小鼠病情显著改善,故体重和状态均得到恢复。 其次,我们对脓毒症相关的炎症和脏器功能指标进行检测。 既往研究主要对单一时相点或7 d 内的炎症和脏器功能指标检测[21]。 同样采用烫伤+铜绿假单胞菌感染,观察发现,伤后7 d 小鼠炎症指标虽有下降,但仍处于高位。 我们的结果则与单独注射细菌模型的研究结果更为接近,即注射后24 h 内达到峰值,随后逐渐下降,7 d 基本恢复。 该差异可能与我们的模型死亡率偏低,而该作者的研究中细菌菌量偏高有关。 对于脏器功能指标而言,我们发现模型组小鼠肝织在各个时相点可见大量炎性细胞浸润和显著的肝细胞水肿和坏死此外模型小鼠血清ALT、AST、UREA 和CREA 等反映急性肝、肾功能损伤的指标也持续升高,且在伤后7 d 仍高于对照小鼠,表明肾功及肝功能在该模型中影响显著。 我们前期在单独脓毒症模型小鼠中并未观察到肝出现显著的坏死现象,但在本模型中肝组织坏死非常显著,提示多重打击下,机体脏器功能可能发生叠加损伤效应,该现象值得进一步研究探讨。 既往多次研究结果表明,脓毒症模型组的小鼠死亡集中发生在建模后2～6 d(占死亡数的90%左右),这期间的死亡无明显的趋势。 模型组死亡情况均发生于24 h 以后(烫伤后感染期),符合当前国际通用的“二次打击”模型(two-hit model)的特点和基本要求[22],即一次打击(创伤)导致亚致死性伤情,二次打击(感染)引发模型动物死亡。 同时也与当前临床烧伤患者多能度过早期休克期,但易并发后续感染,引发脓毒症并导致预后不佳的病理生理特点较为一致[23]。

常用的脓毒症模型包括:(1)盲肠结扎穿孔术(CLP)造成单纯的腹腔感染。 该模型是应用较广泛,具代表意义的一种模型,更类似于人类脓毒症的进展和特点。 但该模型对施术者手法和动物个体差异的影响较大,不易操作。 (2)采用细菌(内毒素)对机体的直接损伤。 该模型易于控制,模型重现性较好。 但并不完全模拟脓毒症的发病过程。更为重要的是,上述模型与烧烫伤后创面感染所致脓毒症具有一定的差异,并不能有效模拟其临床病程[24]。 此外,目前已有的创面脓毒症动物模型缺乏标准化的操作方法,同时尚未进行长时段的指标检测。 为此,本实验在规范制作烫伤创面和标化痂下细菌接种的同时,对模型小鼠各项指标进行了长时段观测。 结果显示,该模型可以提供了一个较好的讨论烫伤创面与烫伤脓毒症关系的感染模型,同时较好的反应其病理发展过程中的休克期、感染期及修复期的阶段性变化规律,为研究轻度烫伤合并创面感染提供了一种良好的动物模型,较其他模型可能更适于临床轻度创面烫伤脓毒症的相关研究,也为开展不同类型的脓毒症临床药物、临床治疗、机制研究等提供合适的动物模型。

创面脓毒症的发生机制及治疗方法的研究一直是研究的热点与重点。 建立标准化的脓毒症动物模型是探索全身性感染、感染性休克和多器官功能障碍综合症的病理生理学机制和防治措施的需要。