刘 超，何 平，罗明有，王 松，周瑞平，刘 江，付雨晴，胡 斌，张 玉，唐代云

（1.四川省宜宾市叙府酒业股份有限公司，四川宜宾 644600；2.宜宾学院固态发酵资源利用四川省重点实验室，四川宜宾 644600；3.四川轻化工大学，四川宜宾 644600）

大曲是赋予白酒风味的糖化剂和发酵剂，根据大曲不同的制曲顶温可将其分为三类，分别是高温大曲、中温大曲、低温大曲，其中高温大曲主要运用于酱香酒生产，中温大曲用于浓香酒的生产，低温大曲用于清香型白酒生产。中温大曲发酵顶温一般在50～60 ℃，不同大曲原料和工艺参数略有不同，但步骤基本相同，中温曲的制作主要分为原料的粉碎、成型、培菌、入库储存、使用等几个阶段。

在对中温曲的研究中，胡晓龙等基于高通量测序对中温大曲曲皮和曲心微生物群落结构进行解析，表明曲皮中真菌群落多样性和丰度均高于曲心样品，曲心中细菌群落多样性高于曲皮，丰度低于曲皮；唐贤华运用PCR-DGGE 技术探究不同发酵期与贮存期的中温大曲微生物群落结构，结果显示，发酵4～8 d 微生物数量达到顶峰，储存期微生物种类基本稳定，数量变化较大。

伴随着白酒产量的不断提升，对大曲的需求量也越来越大，传统人工踩制已无法满足需求。20世纪70 年代我国各大中型酒厂开始逐步试验使用大曲压块机，机制曲在行业的使用比例日渐提高，但质量与传统人工曲相比还存在一定差异。林培等研究人工踩制和机械压制对大曲的影响，人工曲在香气程度、断面整齐度、皮张厚度等方面均优于机械曲；人工大曲的水分、酸度、糖化力、液化力略高于机制大曲，机制曲高级醇、醛类物质远低于人工曲；传统曲的细菌种类较机械曲少，真菌种类则比机械曲更为丰富。Wang 等基于高通量测序也研究了传统和机械大曲的微生物群落结构。本研究利用高通量测序技术结合理化检测对人工与机制中温大曲的微生物群落结构和理化差异进行分析比较，意在找出二者理化与微生物差异的原因，为改善大曲的品质提供参考意见。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂及仪器

曲样：取夏季生产储存6 个月达到使用条件的机制曲和人工曲各20 块，粉碎后混合均匀再各取200 g 装进无菌密封袋，人工曲标记为DQ01，机制曲标记为DQ02，每个样品取3 个平行样，高通量试样保存于-20 ℃冰箱等待DNA提取。

试剂及耗材：酚酞指示剂、95 %乙醇、氢氧化钠、邻苯二甲酸氢钾、冰醋酸、乙酸钠、葡萄糖、硫酸铜、丙三醇、碘化钾、可溶性淀粉、硫酸、盐酸，成都市科龙化工试剂厂。

仪器设备：烘箱；电热恒温水浴锅，上海齐欣科学仪器有限公司；Pico-21 台式离心机，Thermo Fisher 公司；GL-88B 漩涡混合器，海门市其林贝尔仪器制造有限公司；TND03-H-H 混匀型干式恒温器，深圳拓能达科技有限公司；DYY-6C 型电泳仪电源，北京市六一仪器厂；DYCZ-21 电泳槽，北京市六一仪器厂；Biodoc-IT凝胶成像系统，美国UVP公司；Qubit®3.0 荧光计，Invitrogen 公司；T100PCR仪，美国BIO-RAD公司。

1.2 试验方法

1.2.1 DNA提取

具体提取步骤参照OMEGA 试剂盒E.Z.N.ATM Mag-Bind Soil DNA Kit 的试剂盒使用说明书（网址链接：http://omegabiotek.com/store/product/soil-dna-kit/）。

1.2.2 PCR 扩增

细菌基因PCR 扩增所用引物采用Miseq 测序平台的V3—V4通用引物。

338F 引 物：5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′。

806R 引 物：5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′。

真菌基因PCR所用引物为ITS1-2通用引物。

ITS1F 引物：5′-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3′。

ITS2R 引物：5′GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3′。

真菌、细菌PCR 条件均为：95 ℃预变性2 min，95 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，25次循环后，72 ℃延伸5 min，10 ℃保持至停止。PCR 扩增后，产物用2 %琼脂糖进行电泳检测，回收产物再用Qubit3.0 试剂盒进行精确定量，最后在Miseq平台完成测序。

1.2.3 大曲理化指标的测定方法

大曲理化指标检测参考Q/WLYJ07.05LHY。

1.2.4 数据统计分析

测序数据使用R 语言制作Venn 图、稀释曲线图及优势门、属的堆叠柱状图。

2 结果与分析

2.1 理化指标检测（表1）

表1 大曲理化指标

由表1 可知，机制曲酸度、发酵力较人工曲高，水分、糖化力、液化力比人工曲低，可能是制曲时机制曲的提浆效果不如人工曲，使得其发酵初期升温快、湿度高，有利于细菌生长代谢，从而产生更多的酸类物质，但后期储存的过程中保水能力差，不利于微生物的生长，尤其是霉菌，霉菌是产糖化酶、液化酶的主要菌种，导致机制曲糖化力、液化力稍低于人工曲。机制曲酸度更大的环境适于酵母的生长，让酵母成为了相对的优势菌种，体现在大曲指标上就是机制曲拥有更高的发酵力。

2.2 Alpha多样性分析（表2）

表2 为不同制曲方式大曲的真菌和细菌Alpha多样性指数，在97 %一致性的水平上完成样品的Alpha 多样性指数分析。Coverage 值为样本序列的覆盖率，Coverage 值的大小和样本中物种被检测出来的几率成正比，样本检测显示Coverage 数值达到0.99，即认为本次测序结果可以代表样本的真实情况，达到准确反映细菌、真菌群落的种类及结构的要求。在不同制曲方式中温大曲中，人工曲DQ01样品真菌的Ace、Chao1、Shannon 指数均高于机械曲DQ02，而Simpson 指数低于DQ02，说明人工曲检出真菌物种总数较多且分布均匀；DQ01 细菌的Ace、Chao1 指数均低于DQ02，说明DQ02 细菌群落较DQ01 更为丰富。结合理化初步分析造成机制曲与人工曲细菌和真菌丰富度和多样性差异的原因为机制曲压曲较为紧实，水分挥发较慢，发酵初期温度高、湿度高、厌氧的环境给细菌生长繁殖创造了有利条件，人工曲更为疏松，水分及时挥发有利于真菌的生长。

表2 Alpha多样性分布表

图1（A）直观反映了不同制曲方式大曲样品中细菌共有的OTU 及特有的OTU，由图1（A）可知，机械和人工曲样品中细菌共同的OTU 有52 个，机械曲特有的OTU 为11 个，人工曲特有OTU 仅为2个；由图1（B）可知，在真菌方面共有的OTU 有32个，机械曲特有OTU 为2 个，人工曲特有OTU 为6个。说明机制曲在细菌方面多样性更好，人工曲的真菌多样性更丰富，可以反映出两者理化存在差异，机制曲更适合细菌生长。

图1 细菌和真菌在属水平韦恩图

2.3 微生物群落结构分析

根据测序结果首先在门水平上对样品数据进行分析，由图2（A）可知，DQ01 中细菌在门水平上检出相对丰度前5的分别是变形菌门Proteobacteria(70.35 %)、厚壁菌门Firmicutes(12.01 %)、蓝藻门Cyanobacteria_Chloroplast(8.82 %)、未分类的细菌门unclassified_Bacteria(7.85%)、其他Other(0.97%)，DQ02 在门水平上检出的丰富度前4 依次是变形菌门Proteobacteria(87.38 %)、厚壁菌门Firmicutes(9.37 %)、蓝藻菌门Cyanobacteria _ Chloroplast(1.51 %)、其他Other(1.74 %)。不管是机械还是人工曲变形菌门和厚壁菌门都是优势门，机械曲中两者的相对丰度更是达到了96.75 %，两者的优势地位与Zhang等对清香型大曲细菌组成及多样性研究基本相似，制曲温度不同两者在丰富度上也各有差异，樊建辉研究陶香型大曲也证实厚壁菌门为优势菌门，其次为变形菌门，王晓丹用高通量测序对酱香大曲进行研究，检出的细菌门主要为厚壁菌门、变形菌门等，即在门水平上机械与人工曲细菌的多样性较为相似，但蓝藻菌门相对丰度仅为人工曲的1/8 左右，可能是机制曲水分含量低不适于蓝藻菌门生长繁殖。真菌方面DQ01 门水平上丰富度前4 的依次为毛霉门Mucoromycota(52.53%)、子囊菌门Ascomycota(43.78 %)、未分类的unclassified(3.05%)、其他Other(0.64%)，DQ02 检测出子囊菌门Ascomycota(91.65 %)、毛霉门Mucoromycota(6.71 %)、未分类的unclassified(1.54 %)、其他Other(0.1 %)。可以发现子囊菌门和毛霉门占据菌群的绝大部分相对丰度，郭敏对传统与机械酱香大曲制曲过程中的微生物进行研究，显示子囊菌门在入房、一翻、二翻、出房中均为第一大优势门，前三阶段相对丰度超99%，李申奥对兼香高温大曲的研究及Hu对白云边大曲的研究同样得出子囊菌门为最优势菌门。DQ02 中子囊菌门与毛霉门相对丰度差值达84.94 %，造成二者差异的原因可能为机制曲紧实且翻曲次数少，发酵温度高不利于毛霉门菌类的生长。

图2 门水平的群落结构分析图

图3 属水平的群落结构分析图

属水平结果显示，人工曲细菌属相对丰度情况为未分类肠杆菌属unclassified_ Enterobacteriaceae(68.84%)、链球菌属(8.82%)、未分类细菌属unclassified_Bacteria(7.85 %)、Other(3.7 %)、葡萄球菌属(3.5 %)、魏斯氏菌属(2.48 %)、片球菌属(2.24 %)、乳杆菌属(1.56 %)、芽孢杆菌属(1.02 %)，机械曲细菌属相对丰度为不动杆菌属(80.52 %)、其他Other(5.26 %)、未分类肠杆菌属unclassified_Enterobacteriaceae(3.49 %)、乳杆菌属(2.44 %)、假单胞菌属(1.91%)、片球菌属(1.87%)、魏斯氏菌属(1.68 %)、(1.51 %)、高温放线菌属(1.33%)。

人工曲中肠杆菌属和链球菌属占据相对丰度优势，刘雄对中、高温大曲固态发酵过程微生物菌群结构变化的研究表明肠杆菌属和链球菌属在中、高温曲中为优势菌种，发酵结束时肠杆菌属在中、高温曲中相对丰度分别为77 %、83 %，机制曲中不动杆菌属为绝对优势菌种。资料显示，肠杆菌属一条代谢路径的主要终产物为混合有机酸，包括琥珀酸、乳酸、乙酸和甲酸，另一代谢路径的主要产物为中性溶剂，包括乙醇和丁二醇，肠杆菌属在红腐乳后酵期发酵过程中还与赖氨酸、苯丙氨酸等大部分氨基酸呈显著正相关，促进腐乳中氨基酸浓度的升高；不动杆菌属因其含有丰富的酯水解酶，能促进辛酸乙酯的合成，与以辛酸乙酯为主酯类的风味化合物呈正相关，据报道不动杆菌属还与制曲过程中吡嗪类物质的合成有关；葡萄球菌属可以产生3-甲基-1-丁醇和乙偶姻等风味物质，成为白酒风味物质的前体；乳杆菌属与魏斯氏菌属具备代谢产生乙酸、乳酸等有机酸的能力，这些酸是白酒中重要的风味成分；魏斯氏菌属还具有一定耐酸性，能分解葡萄糖产二氧化碳；高温放线菌属耐高温、生长快、可产蛋白酶及纤维素酶，酶在较高温度下仍能保持酶活及稳定性，是白酒风味物质的重要来源；芽孢杆菌有较强的蛋白和淀粉分解能力，为美拉德反应初期生成阿马多利化合物提供充足的原料，为提升酒质的重要菌种。

人工曲真菌属相对丰度前9 为毛霉属(36.05%)、伊萨酵母属(18.41%)、根霉属(15.77 %)、曲霉属(7.81 %)、其他Other(6.87 %)、假丝酵母属(5.4 %)、芽生葡萄孢酵母属(3.4 %)、嗜热真菌属(3.26 %)、未分类真菌属unclassified(3.05 %)，机械曲为伊萨酵母属(71.36 %)、嗜热真菌属(11.02 %)、毛霉属(6.37 %)、其他Other(4.63 %)、孢圆酵母属(3.25%)、生丝毕赤酵母属(1.81 %)、未分类真菌属unclassified(1.54 %)，人工曲霉菌属的相对丰度占总丰度约60%，酵母属占总丰度约30%，机制曲酵母的相对丰度约80 %，其余仅剩少量的嗜热真菌及霉菌。液化酶、糖化酶、酯化酶、纤维素酶、果胶酶等主要来源于霉菌，霉菌降解淀粉产生葡萄糖供其他微生物利用，是白酒酿造中的动力源泉。根霉在大曲发酵过程中菌丝体生长至曲醅内部，分泌各种酶到曲醅环境中促进曲的成熟，也具有产乙醇、甲基丁酮等风味物质的能力；毛霉属作为大曲中极为重要的霉菌，主要富集于制曲的低温培菌期，能分泌蛋白酶促进曲的分解；曲霉主要分泌酸性水解酶，例如酸性淀粉酶、酸性蛋白酶等，这些酶具有耐乙醇、耐酸的特性，使其能够在酸性发酵条件下酶解原料中的淀粉和蛋白质，为发酵提供动力，牟穰等研究黄酒生产过程中微生物及风味的关联显示，曲霉属与异戊醇、异丁醇、乙酸乙酯、己酸乙酯等风味物质有关；伊萨酵母属是一种广泛存在于酿酒生产中、能够产生乙醇的酵母属，具有耐热性好、耐酒精能力强和乙酸乙酯产生量高，产异戊醇和正丙醇能力比酿酒酵母低2～3倍的特点；假丝酵母属在大曲发酵过程中是非常重要的真菌，产酒精以及酯类物质，如异戊酸、苯乙醛、辛酸乙酯等，也可产生酚类、酮类和烯类等挥发性香味化合物，对大曲质量起到积极的影响。谭崇尧研究不同地域浓香型大曲微生物结构得出：不论是北方派、长江中游派、江淮派、川派，嗜热真菌属为共有的优势真菌；孙利林分析了不同厂酱香大曲的微生物菌群结构以及杨少勇对襄阳地区高温大曲和中高温大曲真菌多样性解析也都表明嗜热真菌属为优势真菌，说明嗜热真菌属基本没有地域差异。机制与人工曲两者真菌相对丰度不同主要由机制曲前期升温较快较高，后期水分较少造成。

为探究机械和人工大曲样品在类群上的相似性程度，从制曲方式物种两个层面进行了聚类分析，并绘制出相对丰度聚类热图，更加直观的体现大曲样品细菌及真菌属在组间丰度和样本间多样性的异同，颜色深浅代表的是物种丰度。由图4 可知，横向聚类分析结果显示DQ01 与DQ02 不管在细菌还是真菌属上均可分为一类，纵向表示不同物种在制曲方式间丰度的相似性情况。细菌聚类热图分析结果显示，和unclassified_Enterobacteriaceae丰度相似性较大，和物种丰度相似性较大，和丰度相似性好；真菌聚类热图结果显示，和、和、与的丰度相似性好。

图4 微生物群落聚类树形图

3 结论

本研究以存储6 个月机制曲和人工曲为研究对象，采用高通量测序技术对两者的微生物群落结构和多样性进行分析，并辅以理化检测，结果表明：在细菌属中，人工曲以肠杆菌属、链球菌属、葡萄球菌属、魏斯氏菌属、片球菌属、乳杆菌属、芽孢杆菌属为主；机制曲以不动杆菌属、肠杆菌属、乳杆菌属、假单胞菌属、片球菌属、魏斯氏菌属、链球菌属、高温放线菌属为主；在真菌属中，人工曲优势菌种为毛霉属、伊萨酵母属、根霉属、曲霉属、假丝酵母属、芽生葡萄孢酵母属、嗜热真菌属；机制曲则为伊萨酵母属、嗜热真菌属、毛霉属、孢圆酵母属、生丝毕赤酵母属。机制曲酸度、发酵力较人工曲高，糖化力、液化力较人工曲低，导致两者微生物及理化差异的主要原因可能是机制曲紧实度与水分含量高、提浆效果较差，发酵初期高温高湿厌氧的条件利于细菌生长，产酸类物质多，且不利产糖化酶、液化酶的霉菌生长，这也与测序结果相印证，机制曲细菌多样性较好，真菌多样性差，丰富度集中在少数菌种上，而人工曲刚好相反，细菌多样性较差，真菌多样性较好，丰富度在每个菌种上分布均匀。对机制和人工曲微生物群落结构及多样性差异的后续研究还需在考虑生长环境的基础上结合转录组学、代谢组学以及蛋白质组学开展。本研究为了解采用不同制曲方式的大曲微生物群落结构的差异提供了基础数据，同时对改进制曲工艺，针对不同制曲方式“对症下药”有极大帮助。