王建田，谭显修，刘喜伟，徐 月，满益龙，周 勇

（1. 隆回县七江镇农业综合服务中心，湖南 隆回 422205；2. 隆回县荷田乡农业综合服务中心，湖南 隆回 422204；3. 湖南省农业科学院农业生物技术研究所，湖南 长沙 410125）

我国是世界上第一大柑橘生产国，柑橘产业已成为我国南方丘陵山区的农业支柱产业，在国民经济中占有十分重要的地位[1]。柑橘溃疡病是全世界范围内危害柑橘生产的主要检疫性病害，在我国主要柑橘产区几乎皆有发生，对柑橘产业造成了严重损失[2]。喹啉铜等有机铜制剂是目前化学防治柑橘溃疡病的理想药剂，与无机铜制剂相比，其具备良好效果的同时对作物更加安全[3]。然而，过量使用喹啉铜可能会导致病菌产生抗性、农产品质量安全和环境污染等问题。为确保我国柑橘产业绿色高质量发展，农药减施增效综合技术体系的建立势在必行[4]。2021 年9 月3 日实施的食品安全国家标准 食品中农药最大残留限量（GB 2763—2021）中规定，柑橘中喹啉铜的最大残留限量为5 mg/kg[5]。

关于喹啉铜在梨[6]、西瓜[7]、杨梅[8]、黄瓜[9]、水稻[10]、马铃薯[11]、枇杷[12]、苹果[13]等基质中的残留检测方法已有报道。柑橘中包含果胶、类胡萝卜素、纤维素等多种成分，基质组成较为复杂，而采用超高效液相色谱-串联质谱法（UPLC-MS/MS）检测柑橘中喹啉铜残留量的方法目前尚无报道。因此，该研究针对柑橘基质，建立了一种以QuEChERS（Quick、Easy、Cheap、Effective、Rugged、Safe）前处理方法为基础，结合超高效液相色谱-串联质谱法测定柑橘中喹啉铜残留量的方法，旨在为柑橘生产中喹啉铜合理使用和柑橘产品质量安全提供保障。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试柑橘样品采集于湖南省园艺研究所果树创新园。

主要试剂有8-羟基喹啉铜（98.8%，上海安谱实验科技股份有限公司），乙腈（色谱纯，德国默克股份有限公司），甲醇（色谱纯，德国默克股份有限公司），甲酸（色谱纯，德国CNW 科技公司），PSA、C18、GCB（德国CNW 科技公司），试验用水为超纯水。

主要仪器设备有TSQ Endura 三重四极杆液质联用仪（赛默飞世尔科技公司），TDZ5-WS 低速离心机（湖南平凡科技有限公司），TG16-II 高速离心机（湖南平凡科技有限公司），ME104 电子天平[梅特勒-托利多国际贸易（上海）有限公司]，JY5002 电子天平（上海舜宇恒平科学仪器有限公司），MTV-100 旋涡混合仪（杭州奥盛仪器有限公司），XW-80A 微型漩涡混合仪（上海沪西分析仪器厂有限公司），等。

1.2 试验方法

1.2.1 标准品溶液的配制称取喹啉铜标准品0.025 2 g，用甲醇溶解并定容至25 mL，配制成996 mg/L 的母液。将喹啉铜母液用甲醇稀释配制成浓度为100 mg/L 的标准溶液，再将100 mg/L 的标准溶液用甲醇稀释配得浓度为2、1、0.5、0.2、0.1、0.05、0.02、0.01 mg/L 的系列标准溶液。

1.2.2 基质效应分析使用液相色谱-串联质谱进行定量分析时通常会出现基质效应，在建立检测方法时可以按照以下公式对基质效应进行评估：ME（%）=（A/B）×100，当ME 在80%～120%之间时为弱基质效应，无需采取措施补偿基质效应；当ME 在50%～80%或120%～150%之间时为中等基质效应，当ME ≤50%或≥150%时为强基质效应，均需采取补偿措施[14]。

1.2.3 样品处理（1）样品预处理。果肉样品：先去除柑橘果皮，然后用不锈钢刀将果肉切成1 cm 大小的碎块，在不锈钢盆中混匀后进行分取，然后用匀浆机进行匀浆。全果样品：将柑橘全果用不锈钢刀切成1 cm 大小的碎块，在不锈钢盆中混匀后进行分取，然后用匀浆机进行匀浆。（2）样品前处理。用天平称取5 g 匀浆后的柑橘样品至50 mL 离心管中，在离心管中加入提取液；该研究以乙腈-水（体积比1 ∶1）溶液中添加不同浓度的甲酸（0、0.1%、0.5%）对样品进行提取；涡旋3 min，4 000 r/min 离心3 min。取2 mL 离心管，预先称取20 mg 净化剂（该研究采用PSA、C18、GCB、PSA+C18、PSA+C18+ GCB 共5种净化材料分别对果肉和全果样品进行净化处理），加入1.5 mL 上一步的乙腈提取溶液，漩涡1 min。再置于10 000 r/min 的高速离心机上离心3 min，移取上清液过0.22 μm 滤膜，滤液即可上机测定。

1.2.4 色谱条件优化（1）色谱柱选择：分别采用Hypersil GOLD C18（100 mm×2.1 mm，1.9 μm）和Mixed-Mode HILIC-1（150 mm×2.1 mm，3 μm）这2 款色谱柱进行检测，根据分离效果选择更合适的色谱柱。（2）流动相的确定：分别比较了喹啉铜在0.1%甲酸水-0.1%甲酸乙腈溶液、0.1%甲酸水-0.1%甲酸甲醇溶液、0.1%乙酸铵水-乙腈溶液3 种流动相下的响应强度，依据峰形和保留时间确定最佳的流动相。其他色谱条件如下：柱温35℃，流速为0.3 mL/min，进样量为5 μL。

1.2.5 质谱条件优化配制1 mg/L 的标准溶液，使用全扫描模式确定目标物的母离子，优化离子喷雾电压、喷针温度、离子传输管温度、鞘气压力、射频透镜电压等参数后对二级质谱进行扫描，选择信号最强的2个子离子作为特征子离子。然后在子离子扫描模式下同时对射频透镜电压和碰撞电压进行优化，最后确定最佳的质谱参数条件。电离源模式为ESI，电离源极性为正，雾化气为氮气，鞘气压力为275 790 Pa，离子传输管温度为320℃，喷针温度为300℃，离子喷雾电压为3 500 V，采用手动调谐对射频透镜电压和碰撞电压进行优化，在选择反应检测扫描（SRM）模式下进行检测。

1.2.6 方法验证（1）标准曲线绘制和基质效应：柑橘基质较为复杂，即使采用净化剂进行了净化处理，剩余的基质成分仍然对目标农药的检测有干扰。用乙腈-水（体积比1 ∶1）溶液和空白基质提取液分别配制0.01、0.02、0.05、0.1、0.2、0.5、1、2 mg/L 系列浓度的标准工作液，每个浓度重复测定3 次，采用外标法定量。以进样质量浓度为横坐标、对应的峰面积为纵坐标，分别绘制标准曲线。（2）方法的回收率、精密度和定量限：分别采用空白柑橘果肉和全果进行添加回收试验，添加浓度为0.05、0.1、5、10 mg/kg，每个浓度重复5 次，考察方法的回收率和精密度，以添加的最低浓度作为方法的定量限。

1.2.7 样品检测采用建立的方法对购于本地市场和超市的12 个柑橘样品进行检测，分别测定果肉和全果中喹啉铜的含量。

2 结果与分析

2.1 质谱条件的优化

优化后选择信号相对较强的118.111 作为定量离子，相应相对较弱的128.111 作为定性离子，筛选出146.183/118.111 作为定量离子对，146.183/128.111 作为定性离子对，优化碰撞电压进而得到最佳的离子信号强度，获得喹啉铜标准溶液的色谱图如图1 所示。然后在子离子扫描模式下同时对射频透镜电压和碰撞电压进行优化，最后确定最佳的质谱参数条件为：保留时间1.23 min，母离子146.183 m/z，子离子118.111/128.111 m/z，碰撞电压25/22 V，射频透镜电压122 V。

图1 0.01 mg/L 喹啉铜标准溶液的色谱图

2.2 色谱条件的优化

试验结果显示，使用Hypersil GOLD C18 色谱柱时，溶剂标液出峰峰形较好，但基质匹配标液出峰峰形差；使用Mixed-Mode HILIC-1 色谱柱时，溶剂标液和基质匹配标液出峰峰形均较好，故选择Mixed-Mode HILIC-1 色谱柱进行洗脱分离。在相同梯度洗脱条件下，比较了喹啉铜在0.1%甲酸水-0.1%甲酸乙腈溶液、0.1%甲酸水-0.1%甲酸甲醇溶液、0.1%乙酸铵水-乙腈溶液3 种流动相下的响应强度，结果表明流动相为0.1%甲酸水-0.1%甲酸乙腈溶液时，喹啉铜的峰形更好且响应较高，因此选择0.1%甲酸水-0.1%甲酸乙腈溶液作为液相流动相条件。液相洗脱条件如表1 所示。

2.3 提取条件的优化

试验结果显示，添加甲酸比不添加甲酸得到回收率更高，推测酸性条件有利于喹啉铜的离子化效率，进而提高添加回收率；添加0.1%和0.5%甲酸得到的回收率结果相当，从节约成本的角度考虑，最终确定甲酸的添加浓度为0.1%。

2.4 净化条件的优化

试验结果显示，采用PSA 对果肉样品进行净化、C18 对全果样品进行净化，得到的净化效果较好、回收率结果最佳，故筛选出适合柑橘果肉和全果的净化剂分别为PSA 和C18。果肉样品中加入20 mg PSA，全果样品中加入20 mg C18。

2.5 方法的线性范围和基质效应评价

由表2 可知，在0.01～2 mg/L 浓度范围内，喹啉铜的质量浓度和峰面积呈良好线性关系，决定系数分别为0.998 2、0.998 9 和0.999 4；柑橘果肉和全果的基质效应分别为48%和42%，均为基质减弱效应。

表2 标准曲线和基质效应

2.6 方法的回收率、精密度和定量限

由表3 可知，在0.05、0.1、5、10 mg/kg 4 个添加水平下，喹啉铜在柑橘果肉和全果中的平均回收率分别为99%～103%、91%～97%，RSD分别为1.9%～6.1%、3.0%～8.4%，喹啉铜在柑橘果肉和全果中的定量限均为0.05 mg/kg，结果符合NY/T788—2018[15]的要求。柑橘果肉、全果空白样品的色谱图见图2，添加样品色谱图见图3。

图2 空白样品色谱图

图3 加标样品色谱图（0.1 mg/kg）

表3 喹啉铜在柑橘果肉和全果中的添加回收率和相对标准偏差（n=5）

2.7 样品检测

采用优化后的提取检测方法对购于本地市场和超市的12 个柑橘样品分别进行果肉和全果检测，结果显示，12 个样品果肉中喹啉铜的含量范围为≤0.15

mg/kg，全果中喹啉铜的含量范围为≤0.32 mg/kg。

3 结 论

该研究使用超高效液相色谱-串联质谱法（UPLC-MS/MS）检测柑橘中喹啉铜的残留量，对样品处理方法、色谱条件和质谱条件进行了优化。结果表明：样品经含0.1%甲酸的乙腈-水（体积比1 ∶1）溶液涡旋提取，果肉样品使用20 mg PSA 净化，全果样品使用20 mg C18 净化；采用Mixed-Mode HILIC-1色谱柱分离，以0.1%甲酸水-0.1%甲酸乙腈溶液作流动相进行梯度洗脱，洗脱流速为0.3 mL/min，柱温为35℃；在选择反应检测扫描（SRM）模式下进行测定，喹啉铜在0.01～2 mg/L 范围内性关系良好，决定系数均≥0.998 2，喹啉铜在柑橘果肉和全果中的最低检测浓度均为0.05 mg/kg，添加回收试验中喹啉铜在柑橘果肉和全果中的平均回收率范围为91%～103%，相对标准偏差范围为1.9%～8.4%。该方法操作简便、快速，准确度和精密度高，适用于柑橘中喹啉铜残留量的检测。