邹修为，熊有明，谢剑波，肖志鹏，颜 瑾，陈 武，唐前君，王运生

（1.湖南农业大学植物保护学院，湖南 长沙 410128；2.衡阳市烟草公司，湖南 衡阳421001；3.邵阳市新邵县农业农村局，湖南 新邵 422900）

辣椒（Capsicum annuumL.）是我国种植面积最大的蔬菜作物之一[1]。随着我国设施蔬菜栽种面积逐年增加，辣椒疫病已成为严重影响辣椒产量和品质的一种毁灭性土传病害。其病原菌辣椒疫霉（Phytophthora capsici）寄主广泛，可以在土壤中长期存活，一旦传入就难以根治，严重时可造成毁棚，带来巨大经济损失。随着人们环保意识的不断增强，生物防治已逐渐成为植物病害绿色防控的重要选项，在防治蔬菜病害方面优势凸显。已有多种辣椒疫霉生防菌的报道[2-3]，部分生防菌兼具拮抗和促生作用[4]，大多数生防菌是从根际土壤中分离得到的。

黑水虻（Hermetia illucensL.）作为腐食性昆虫，能够取食禽畜粪便和生活垃圾，转化为昆虫蛋白质和脂肪。黑水虻虫粪，又称虫沙，可开发为优质有机肥，从黑水虻肠道中挖掘有益微生物，可直接利用黑水虻幼虫生物反应器生产生物有机肥。近年来，黑水虻作为环保昆虫，广泛应用于禽畜粪便、餐厨垃圾、农业有机废弃物的资源化利用[5]。黑水虻肠道中含有非常丰富的微生物，这些肠道微生物对于黑水虻消化吸收有机垃圾中的营养物质具有十分重要的作用[6]。同时，丰富的黑水虻肠道微生物也是挖掘有益微生物的宝库，例如具有抗菌活性的枯草芽孢杆菌[7]、产蛋白酶和有机磷分解酶的有益菌等[8]。黑水虻虫粪可作为优质有机肥，黑水虻肠道微生物具有作为生物菌肥益生菌开发的潜力，来自黑水虻肠道的有益微生物，由于在同一生态位经历协同进化，经黑水虻肠道后可在虫粪中长时间稳定存活，从而延长生物菌肥的货架期。

Y4-39 菌株就是笔者所在实验室前期从黑水虻肠道中分离、纯化的一株对辣椒疫霉菌具有高效抑菌活性的生防菌，该研究通过形态学、生理生化检测及16S rDNA 序列对其进行鉴定，并测试了该菌株所产抑菌物质对热、光及蛋白酶的敏感性，还通过盆栽试验比较了不同发酵液剂量处理对辣椒疫霉的防治效果，以期为该菌株的后续开发利用奠定基础。

1 材料与方法

1.1 供试昆虫和菌株

黑水虻种群为课题组保存种群，最初来源为武汉品系。辣椒疫霉病菌（Phytophthora capsici）LYB-1 由湖南省农业科学院蔬菜研究所辣椒课题组提供。

1.2 黑水虻肠道菌的分离

选取 3～5 头4 龄健康黑水虻幼虫，首先用无菌水清洗虫体3 次，然后用75%乙醇浸泡幼虫1 min，再用0.1%的升汞浸泡2 min，用无菌水清洗幼虫3 次，置于无菌滤纸上，在无菌条件下解剖取出幼虫的肠道，加入0.5 mL 无菌水于研钵中进行研磨，然后再加入1.5 mL 无菌水，稀释成不同浓度梯度菌悬液，取适宜稀释度的菌悬液涂布在酪蛋白筛选培养基上进行筛选，选取抗辣椒疫霉菌效果较好的菌株进行后续试验。

1.3 菌株形态学及生理生化鉴定

取分离纯化的菌株于LB 平板划线培养、30℃培养24 h 后观察菌落形态，培养72 h 后在显微镜下观察其芽胞形态，并进行革兰氏染色、甲基红试验、V-P试验、淀粉水解试验、接触酶试验、糖醇类发酵试验和耐盐试验等生理生化试验。

1.4 16S rDNA 序列扩增及分析

将筛选保存的菌株（编号Y4-39）在30℃下培养24 h（已达对数生长期），吸取1.5 mL 菌液置于2.0 mL 离心管中，12 000 r/min 离心3 min，弃上清得到菌体沉淀。利用Easy Pure Bacteria Genomic DNA Kit 细菌基因组DNA 提取试剂盒提取Y4-39 菌株的基因组DNA。用细菌通用引物27F 5′-AGAGTTTGATCCTGG CTCAG-3′ 和1492R 5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′进行PCR 扩增，纯化的PCR 产物送往上海生工生物工程股份有限公司测序，组装得到16S rDNA 一致序列后在NCBI 中进行Blastn 序列比对[9]，选择rRNA/ITS 库作为目标序列库，找出相似度较高的的序列。用ClustalW 程序[10]进行多序列比对，用MEGA7.0 软件[11]构建NJ 树。

1.5 拮抗菌Y4-39 发酵液制备

用灭菌牙签挑选单菌落接种到LB液体培养基中，30℃、200 r/min 振荡培养24 h。然后按照1%的接种量接种至LB 液体培养基扩繁，继续培养48 h，发酵液用于后续对峙试验，用无菌培养液调整菌体含量至1×108CFU/mL，用于后续的盆栽试验。

1.6 辣椒疫霉孢子液的制备

将辣椒疫霉菌接种在PDA 平板上，25℃黑暗环境下培养7 d，待其产生大量孢子后，用无菌水洗涤3次，每次加入无菌水2 mL，用无菌毛笔将孢子洗刷下来置于三角瓶中，在光照条件下静置24 h，然后置于4℃冰箱中静置30 min，收集孢子液，用无菌水调整游动孢子含量约1×105CFU/mL，用于后续接种试验。

1.7 抑菌物质稳定性测试

发酵结束后，取发酵液以8 000 r/min 的转速离心5 min 将菌体沉淀，吸取10 mL 上层清液，分别进行如下处理。（1）热稳定性测试温度设置：将上清液分别置于30、40、60、80、100、120℃（120℃处理在高压蒸汽灭菌锅中进行）水浴中处理30 min，以离心后的发酵液上清液为对照（CK）；（2）蛋白酶稳定性测试：分别用蛋白酶K、链酶蛋白酶、胰蛋白酶处理上清液，酶浓度为500 g/mL，37℃水浴处理30 min，以未加蛋白酶的处理为对照（CK）；（3）紫外线稳定性测试处理：将上清液在紫外灯（254 nm）和自然光下分别照射1、2、4、8、16、24 h，以离心后的发酵液上清液为对照（CK）。将上述处理过的上清液（10 mL）添加到30 mL 融化冷至50℃以下的PDA 培养基中，充分混匀后倒平板；用无菌接种环挑取直径为5 mm 的疫霉病菌菌饼置于平板中央，25℃培养，待其病原菌刚长满空白对照平板，用十字交叉法测量其处理平板的病原菌菌落直径，每处理重复3 次。

1.8 生防菌对辣椒疫病的防治作用试验

辣椒苗（湘研5 号）先在育苗盘中长至8～10 叶，然后移栽至直径为10 cm 的花盆中，盆内装有灭菌基质和灭菌土壤（体积比为1∶1），每盆移栽1株辣椒苗。随机分为5 组，每组12 盆。设如下处理：T1，10 mL发酵液+20 mL 无菌培养液；T2，20 mL 发酵液+10 mL 无菌培养液；T3，30 mL 发酵液；CK1（阴性对照），30 mL 无菌培养液；CK2（阳性对照），30 mL 50%烯酰吗啉可湿性粉剂1 000 倍液。将各处理溶液均匀浇灌在辣椒根围土壤上，24 h 后在辣椒苗根部接种5 mL 辣椒疫霉孢子液（游动孢子含量1×105CFU/mL），保湿培养3 d 后进行常规管理。接种后10～15 d 调查发病情况。参照毛爱军等[12]的辣椒疫病分级标准进行调查，计算病情指数和防治效果。

2 结果与分析

2.1 菌株Y4-39 的鉴定

2.1.1 生理生化鉴定经划线纯化后的单菌落形态观察发现，菌株在LB 平板上28℃培养24 h 后，形成4～6 mm 的近似圆形的乳白色菌落（图1），前期边缘较整齐，表面较光滑，后期边缘不整齐，表面粗糙显皱状；革兰氏染色呈阳性（图2），短杆状，两端钝圆，能运动，发酵后期形成芽孢；能水解淀粉，V-P 试验和接触酶反应、葡萄糖产酸、硝酸盐还原、明胶液化及柠檬酸盐利用等试验结果均为阳性（表1）。通过形态学与生理生化测定结果初步判断该菌株为芽孢杆菌。如图3 所示，菌株Y4-39 对辣椒疫霉菌有明显拮抗作用。

图1 菌株Y4-39 的菌落形态

图2 菌株Y4-39 的革兰氏染色结果

图3 菌株Y4-39 对辣椒疫霉菌的拮抗作用

表1 菌株Y4-39 生理生化特性

2.1.2 16S rDNA序列鉴定菌株Y4-39 的16S rDNA基因序列测序结果显示，其大小为1 511 bp。在NCBI进行Blastn 比对，目标库选择16S rRNA/ITS 序列库，结果显示，菌株Y4-39 与Bacillus velezensisFZB42 最相似，相似性为99.67%，选择最相似的20 条序列进行进化分析，以Macrococcus bohemicusCCM 7100 作为外群，采用Neighbor-joining 法，构建系统发育树，结果显示菌株Y4-39 与Bacillus velezensisFZB42 在同一枝上（图4）。综合形态学、生理生化特征和16S rDNA 序列分析，鉴定菌株Y4-39 为贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis）。

图4 菌株Y4-39 的16S rDNA 系统发育树

2.2 菌株Y4-39 抑菌物质的热稳定性

由图5 可知，随着温度的升高，菌株Y4-39 发酵液的抑菌活性呈下降趋势，40℃处理与对照差异不显著，60～80℃处理，抑菌活性有所下降，但依然保持较高抑菌活性，但当温度≥100℃时，抑菌圈直径急剧降低，120℃处理后，抑菌活性丧失。

图5 菌株Y4-39 抑菌物质的热稳定性测试结果

2.3 菌株Y4-39 抑菌物质对蛋白酶的稳定性

由图6 可知，菌株Y4-39 发酵液经蛋白酶K、胰蛋白酶、链酶蛋白酶处理后，对辣椒疫霉菌的抑菌直径分别为14.3、20.2、20.8 mm，与CK 相比，抑菌圈直径分别降低了68.1%、47.3%、47.1%，说明发酵液成分均对蛋白酶敏感，其中对蛋白酶K 最为敏感。

图6 菌株Y4-39 抑菌物质对蛋白酶的稳定性测试结果

2.4 菌株Y4-39 抑菌物质对紫外光的稳定性

由图7 可知，菌株Y4-39 发酵液在自然光下稳定性较好，各处理抑菌活性无明显变化；紫外光处理1～4 h 后，菌株Y4-39 发酵液对辣椒疫霉菌抑菌活性无明显影响，但处理4 h 后，其抑菌活性逐渐降低，紫外线照射24 h 活性最低，其抑菌圈直径为20.5 mm，仅为对照组的53.9%。

图7 菌株Y4-39 抑菌物质对紫外线的稳定性测试结果

2.5 菌株Y4-39 对辣椒疫病的防治作用

从表2 可以看出，3 种剂量处理对辣椒疫霉均具有一定的防治效果，与CK1（空白对照）相比，用菌株Y4-39 发酵液灌根处理能显著降低辣椒疫病的病情指数，其中以T3 处理的病情指数最低，为21.35，略高于CK2（50%烯酰吗啉可湿性粉剂1000 倍液），但二者之间差异不显著。在该试验条件下，T2 和T3 处理防治效果均达到65%以上，二者之间差异不显著，从节省成本的角度考虑，推荐实际使用剂量为20 mL发酵液/株。

表2 生防菌Y4-39 对辣椒疫霉的防治效果

3 讨 论

菌株Y4-39 是从黑水虻肠道中分离纯化的一株对辣椒疫霉和白绢病菌均有较好抑制效果的芽孢杆菌，但对这2 种病原菌的的抑菌活性物质可能不同，初提物经蛋白酶处理后，对白绢病菌的抑菌作用消失，但对辣椒疫霉菌的抑菌作用仅有所下降，但依然具有抑制作用。推测对白绢病菌的抑菌物质主要是抗菌肽类，对蛋白酶敏感，而对辣椒疫霉菌的抑菌物质除了抗菌肽外，还存在其他抗菌物质。课题组对菌株Y4-39 的全基因组序列进行了测序，结果表明，其基因组中至少存在13 个次生代谢产物合成基因簇（结果另发表），包括有表面活性素（surfactin）、大环内酰亚胺H （macrolactin H）、bacillaene、芬枯草菌素（fengycin）、地非西丁（difficidin）、杆菌素（bacillibactin）和杆菌溶素（bacilysin）等。但菌株Y4-39 对辣椒疫霉菌具有抑制作用的活性物质是什么，仍需进一步研究确定。

黑水虻为腐食性昆虫，肠道微生物对其消化、转化有机垃圾的营养元素具有非常重要的辅助作用。黑水虻肠道微生物大部分来自食物和环境，前肠、中肠、后肠微生物种类差异比较大，前肠和中肠受食物和环境微生物的影响显著高于后肠[13]。菌株Y4-39 在黑水虻前、中、后肠和虫粪中均有存在，表明其能在黑水虻肠道中存活、繁殖并从虫粪中排泄出来，具有进一步开发利用的潜力。可以通过人为接种的方式将菌株Y4-39 接种到黑水虻食物中，黑水虻取食、活动后，菌株进一步发酵增殖，从而获得含有大量Y4-39 功能菌的虫沙，从而进一步研发具有生防功能的生物菌肥。通常，生物菌肥中的菌与肥是分开制备，然后再通过物理混合而成[14]。而经黑水虻辅助发酵生产的生物菌肥由于菌与肥是在同一体系中完成的，相互之间经历了相互适应、协合进化过程，菌与肥之间相融性更好，功能菌能更好地存活于菌肥体系，从而提升了菌肥的活性。

该研究鉴定的贝莱斯芽孢杆菌Y4-39 菌株对辣椒疫霉病菌具有良好的抑制效果，盆栽试验结果表明，20 mL 发酵液灌根处理对辣椒疫霉防效达67.78%。贝莱斯芽孢杆菌是一种安全的环境有益菌，在多个领域内得到广泛应用[15]。菌株Y4-39 经黑水虻幼虫发酵后在其虫粪中存在大量活性菌，抗逆性强，能形成芽孢，可开发为具生防功能的生物菌肥。

4 结 论

从黑水虻肠道中分离纯化获得一株对辣椒疫霉菌具有高效抑菌活性的生防菌，编号为Y4-39，经形态学、生理生化和16S rDNA 序列分析，鉴定为贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis）；其抑菌活性物质主要为抗菌肽类物质，能经受80℃以下高温处理，但对蛋白酶和紫外线较敏感；盆栽试验结果表明，菌株Y4-39 发酵液对辣椒疫霉具有良好的防治效果，20 mL/株发酵液灌根处理对辣椒疫霉的防效达67.78%。