李章春孙海波党荣敏叶劲松李珀胡先运杨政敏*

（1.黔南民族医学高等专科学校，贵州 都匀558000； 2.贵州医科大学，贵州 贵阳550004）

慢性非细菌性前列腺炎（chronic abacterial prostatitis，CAP）是临床男科较为常见的病症，占慢性前列腺炎的90%以上［1］，我国成年人发病率为13.5%～21.3%［2］，全球发病率为3%～16%［3］。患者主要表现为腰骶部、会阴部等酸账不适，并伴随尿不尽、尿频、尿急等症状，常用的药物为抗生素、α1-受体阻滞剂、非甾体类抗炎药等，然而，此类药物易引发胃肠出血、头晕等不良反应，服用时间不宜过长，所以疗效并不理想［4］。近年来，随着CAP 治疗药物研究的不断深入，中医药副作用小、疗效好的优势逐渐显现。五香血藤是贵州民间特色苗药，具有消肿镇痛、去风络、抗肿瘤等功效。miR-155 是与炎症、自身免疫等疾病密切相关的一种小分子RNA，能够参与炎症、免疫等多种生物过程［5-6］，TLR4／NF-κB 是经典的信号通路，在细胞氧化应激、炎性反应过程中具有重要作用［7］，通过调控TLR4／NF-κB 信号通路能抑制炎症反应［8］。基于此，本实验研究五香血藤醇提物对CAP 大鼠前列腺组织miR-155表达和TLR4／NF-κB 信号通路的影响并探讨其作用机制。

1 材料

1.1 动物 雄性SPF 级SD 大鼠，体质量200～220 g，由长沙市天勤生物技术有限公司提供，实验动物生产许可证号SCXK（湘）2019-0013。

1.2 试剂与药物 五香血藤购自贵州都匀市中药材市场，经黔南民族医学高等专科学校杨政敏副教授鉴定为正品。取五香血藤15 kg，粉碎，加入萃取釜中，80 L 80%乙醇萃取3次，得浸膏1.2 kg，得率为8%，0.5% 羟甲基纤维素溶液超声溶解，制成灌胃药液。前列舒通胶囊（批号20200909，国药准字Z20027140，保定天浩制药有限公司）；消痔灵注射液（批 号 20022102，国药准字Z22026175，吉林省集安益盛药业股份有限公司）；PrimeScriptTMRT reagent Kit（for real time）（批号RR037A）、SYBR ® Premix Ex TaqTMII（Tli RNaseH Plus）（批 号RR420A）（日本TaKaRa 公司）；DEPC（焦碳酸乙二酯）（批号40718，美国Sigma 公司）；TRIzol Reagent（批号15596026，美国 Ambion公司）；RIPA 裂解液（批 号G2002）、磷酸化蛋白酶抑制剂（批号G2007）、BCA 蛋白定量检测试剂盒（批号G2026）、HRP 标记山羊抗兔（批号GB23303）、HRP 标记山羊抗大鼠（批号GB23302）（上海优选生物科技有限公司）；TNF-α（批号20201008）、IL-6（批号20201020）、IL-8（批号20201011）检测试剂盒（武汉纯度生物科技有限公司）。

1.3 仪器 LightCycler ® 96 型荧光定量PCR 仪（瑞士罗氏公司）；MIKRO220R 型低温高速离心机（德国Hettich 公司）；Rt2100c 型酶标检测仪（美国Rayto 公司）；DYCZ-24DN 型双垂直电泳仪（北京市六一仪器厂）。

2 方法

2.1 分组、造模与给药 60 只大鼠随机分为正常组，模型组，阳性药物组，五香血藤醇提物低、中、高剂量组，每组10只，适应性喂养3 d。按照文献［9］报道，将大鼠用乙醚麻醉，取仰卧位固定在消毒毛巾上，于下腹正中部脱毛、消毒打开腹腔，找到膀胱及两侧的前列腺，将25%消痔灵注射液注入前列腺背叶内0.1 mL／侧，正常组在相同部位注入同体积的无菌生理盐水，逐层缝合，模型形成期7 d，7 d 后开始给药。按照文献［10-11］报道，阳性药物组大鼠灌胃给予前列舒通胶囊水溶液354 mg／kg，五香血藤低、中、高剂量组大鼠灌胃给予药液63、126、252 mg／kg；模型组和正常组灌胃给予等体积无菌生理盐水，每天1次，连续给药28 d。于末次给药2 h后，称定大鼠体质量，股动脉取血后处死大鼠，分离得血清，剥离前列腺、肝脏等组织，滤纸吸干称得湿质量，用4%多聚甲醛将部分前列腺组织进行固定。

2.2 前列腺组织病理学观察 取经过4%多聚甲醛固定的前列腺组织，经常规组织脱水、石蜡包埋、切片等处理后，HE 染色，光镜下进行组织病理学观察。

2.3 Western blot 法检测NF-κB p65、TLR4 蛋白表达 取适量前列腺组织，用冷PBS 洗涤2～3次，剪碎后放置匀浆管中，加入RIPA 裂解液充分匀浆，4 ℃裂解30 min，12 000 r／min 离心10 min，收集上清，即为总蛋白溶液。BCA 法测定蛋白浓度，将蛋白溶液加入蛋白上样缓冲液，沸水浴变性，经SDS-PAGE 电泳分离，转至PVDF膜，5%的脱脂牛奶（0.5%TBST 配制），封闭1 h，加入NF-κB p65（1∶1 000）、TLR4（1∶1 000）一抗，4 ℃孵育过夜，用TBST 清洗3次，再加入二抗，室温下孵育30 min，TBST清洗3次，化学发光法显色，Image J 软件分析灰度值，以β-actin 为内参，计算目标蛋白相对表达。

2.4 RT-qPCR 法检测miR-155 表达 取适量前列腺组织，用冷PBS 洗涤后，TRIzol 法提取细胞总RNA。依照cDNA试剂盒说明进行操作，mRNA 经反转录为cDNA，miR-155以U6 为内参进行PCR 扩增。反应体系（20 μL）为10 μL SYBR premix Ex Taq，0.4 μL 50 × ROX Reference Dye，0.4 μL Primer F（10 μmol／L ），0.4 μL Primer R（10 μmol／L），2 μL cDNA（5 ng／μL），6.8 μL ddH2O；反应条件为95 ℃5 min，95 ℃30 s，60 ℃30 s，95 ℃15 s，共40 个循环。用2-ΔΔCT法计算相对表达量，引物序列见表1。

表1 引物序列

2.5 ELISA 法检测TNF-α、IL-6、IL-8 水平 取大鼠前列腺组织，严格按照试剂说明书进行操作，检测TNF-α、IL-6、IL-8 水平。

2.6 大鼠前列腺组织病理评分 分数赋值标准为0分，前列腺组织结构正常，未见明显炎性改变；1分，前列腺间质有少量的炎细胞浸润，伴随轻度水肿；2分，前列腺间质有炎细胞浸润，水肿明显，1／3 面积以下的腺上皮出现局灶性坏死；3分，前列腺间质炎细胞浸润、水肿明显，1／3＜腺上皮块状坏死＜1／2；4分，前列腺间质炎细胞浸润明显，高度水肿，1／2 以上面积的腺上皮出现坏死。

2.7 统计学分析 通过SPSS 22.0 软件进行处理，数据以（）表示，组间比较采用单因素方差分析并进行多重比较，相关性分析采用Pearson 分析。P＜0.05 表示差异具有统计学意义。

3 结果

3.1 五香血藤醇提物对CAP 大鼠前列腺组织TNF-α、IL-6、IL-8 水平的影响 与正常组比较，模型组大鼠前列腺组织TNF-α、IL-6、IL-8 水平升高（P＜0.05）；与模型组比较，五香血藤醇提物各剂量组TNF-α、IL-6、IL-8 水平降低（P＜0.05），并呈剂量依赖性，见表2。提示五香血藤醇提物能够降低CAP 大鼠炎症因子水平。

表2 五香血藤醇提物对CAP 大鼠前列腺组织TNF-α、IL-6、IL-8 水平的影响（， n＝10）

表2 五香血藤醇提物对CAP 大鼠前列腺组织TNF-α、IL-6、IL-8 水平的影响（， n＝10）

注：与正常组比较，*P＜0.05；与模型组比较，＃P＜0.05；与阳性药物组比较，＆P＜0.05。

3.2 五香血藤醇提物对CAP 大鼠前列腺组织NF-κB p65、TLR4 蛋白表达的影响 与正常组比较，模型组大鼠NF-κB p65、TLR4 蛋白表达升高（P＜0.05）；与模型组比较，五香血藤醇提物各剂量组大鼠NF-κB p65、TLR4 蛋白表达降低（P＜0.05），并呈剂量依赖性，见图1、表3。提示五香血藤醇提物能够抑制CAP 大鼠NF-κB p65、TLR4 蛋白表达。

图1 各组大鼠前列腺组织NF-κB p65、TLR4 蛋白表达

表3 五香血藤醇提物对CAP 大鼠前列腺组织NF-κB p65、TLR4 蛋白表达的影响（， n＝10）

表3 五香血藤醇提物对CAP 大鼠前列腺组织NF-κB p65、TLR4 蛋白表达的影响（， n＝10）

注：与正常组比较，*P＜0.05；与模型组比较，＃P＜0.05；与阳性药物组比较，＆P＜0.05。

3.3 五香血藤醇提物对CAP 大鼠前列腺组织miR-155 表达的影响 与正常组比较，模型组大鼠miR-155 表达升高（P＜0.05）；与模型组比较，五香血藤醇提物各剂量组miR-155 表达降低（P＜0.05），并呈剂量依赖性，见表4。提示五香血藤醇提物能够抑制CAP 大鼠miR-155 表达。

表4 五香血藤醇提物对大鼠前列腺组织中miR-155 表达的影响（， n＝10）

表4 五香血藤醇提物对大鼠前列腺组织中miR-155 表达的影响（， n＝10）

注：与正常组比较，*P＜0.05；与模型组比较，＃P＜0.05；与阳性药物组比较，＆P＜0.05。

3.4 NF-κB p65、TLR4 表达与TNF-α、IL-6、IL-8 水平的相关性 CAP 大鼠前列腺组织内NF-κB p65、TLR4 蛋白相对表达值与TNF-α、IL-6、IL-8 水平呈正相关（P＜0.01），见表5。提示抑制CAP 大鼠NF-κB p65、TLR4 蛋白表达，能够降低TNF-α、IL-6、IL-8 水平。

表5 NF-κB p65、TLR4 表达与TNF-α、IL-6、IL-8 水平的相关性分析

3.5miR-155 表达与NF-κB p65、TLR4 表达及TNF-α、IL-6、IL-8 水平的相关性 CAP 大鼠前列腺组织内miR-155 表达与NF-κB p65、TLR4 表达及TNF-α、IL-6、IL-8 水平呈正相关（P＜0.01），见表6。提示抑制miR-155 表达，能够对NF-κB p65、TLR4 及下游炎症因子发挥正向调控作用。

表6 miR-155 表达与NF-κB p65、TLR4 表达及TNF-α、IL-6、IL-8 水平的相关性分析

3.6 五香血藤醇提物对大鼠前列腺组织病理评分的影响 与正常组比较，模型组大鼠前列腺组织病变平均分值升高（P＜0.05）；与模型组比较，五香血藤醇提物各剂量组与阳性药物组大鼠前列腺组织病变平均分值降低（P＜0.05），见表7。提示五香血藤醇提物能够改善CAP 大鼠前列腺组织病变程度，呈剂量依赖性。

表7 各组大鼠前列腺组织病理评分结果比较（%， n＝10）

3.7 五香血藤醇提物对CAP 大鼠前列腺组织病理学改变的影响 正常组大鼠前列腺组织结构正常；模型组大鼠前列腺组织内慢性炎症细胞浸润、间质毛细血管充血、腺体上皮细胞增生及纤维组织增生等慢性炎症病理学改变未见改善；各给药组大鼠前列腺组织的慢性炎症病理学改变均有不同程度缓解，其中五香血藤醇提物高剂量组大鼠前列腺组织内的慢性炎症细胞浸润、腺体增生、血管扩张充血等慢性炎症病理学改变明显好转，病理改变接近阳性药物组，见图2。提示五香血藤醇提物能够缓解CAP 大鼠前列腺组织炎症病理学改变。

图2 各组大鼠前列腺组织病理切片（HE，×100）

4 讨论

在慢性非细菌性前列腺炎免疫学病因研究中，TNF-α、IL-6、IL-8 均具有高表达。TNF-α 是促炎症细胞因子，在免疫源、感染等因素作用下产生，能够增加一氧化氮合酶和前列腺素的表达，进一步加剧前列腺组织炎症反应［12］；IL-6 是抗炎细胞因子，能够下调TNF-α 等炎症因子的合成，与前列腺炎患者疼痛呈负相关［13］；IL-8 是趋化性细胞因子，在癌症和肿瘤相关研究中具有高表达［14］。在本研究中，与正常组比较，模型组TNF-α、IL-6、IL-8 水平升高；与模型组比较，五香血藤醇提物各剂量组和阳性药物组大鼠的炎症因子水平降低，其中五香血藤醇提物高剂量组下降最为明显，逐渐接近阳性药物组水平，表明五香血藤醇提物能够降低炎症因子水平，并呈剂量依赖性，能缓解CAP 大鼠的炎症。

TLR4／NF-κB 是炎症反应和先天性免疫的重要信号通路，NF-κB 作为关键转录因子是TLR4 信号通路的下游，在免疫应答调节中起到重要作用［7］。激活的TLR4 和NF-κB能够上调TNF-α、IL-6、IL-1 等炎症因子水平，通过降低TLR4、NF-κB 表达可以下调炎症因子水平［15］。在本研究中，与模型组比较，五香血藤醇提物各剂量组的NF-κB p65、TLR4 蛋白表达降低，并呈剂量依赖性，五香血藤醇提物高剂量组和阳性药物组下降最为明显。NF-κB p65、TLR4 表达与TNF-α、IL-6、IL-8 水平呈正相关，表明五香血藤醇提物能够通过降低TLR4 和NF-κBp65 的表达，实现对TNF-α、IL-6、IL-8 水平的下调。

miR-155 是一种亲炎症小分子miRNA，能够参与免疫、炎症、血细胞生成等生物学过程，巨噬细胞和炎症因子能够使其被诱导进而使表达升高［16］。在CAP 模型和前列腺癌研究中，miR-155 能够激活TLR4 使NF-κB 表达升高，通过抑制miR-155 表达能够降低NF-κB 活性［17-19］。在本研究中，与正常组比较，模型组大鼠前列腺组织miR-155 表达升高；与模型组比较，五香血藤醇提物各剂量组miR-155 表达降低，呈剂量依赖性，其中五香血藤醇提物高剂量组下降最为明显，接近阳性药物组水平。miR-155 表达与NF-κB p65、TLR4 表达及TNF-α、IL-6、IL-8 水平呈正相关。病理评分结果表明，五香血藤醇提物高剂量组与阳性药物组平均分值最低；病理学检测显示，五香血藤醇提物高剂量组大鼠前列腺组织内的慢性炎症细胞浸润等病理改变也接近阳性药物组，表明五香血藤醇提物能够通过抑制miR-155表达对TLR4／NF-κB p65 信号通路及下游炎症因子水平发挥调控作用。

综上所述，五香血藤醇提物能够对CAP 大鼠炎症起到缓解作用，其作用机制可能与下调miR-155 表达，抑制TLR4／NF-κB p65 信号通路有关。