吴励萍 张祎盈冯一帆钱大玮朱悦尚尔鑫郭盛康宏杰段金廒*

（1.南京中医药大学，江苏省中药资源产业化过程协同创新中心，江苏 南京210023； 2.中药资源产业化与方剂创新药物国家地方联合工程研究中心，江苏 南京210023； 3.宁夏枸杞创新中心，宁夏 银川750002）

杞菊景明颗粒由菊花、枸杞子、黄芪、当归、茯苓、山楂、益智仁、铁皮石斛、石决明9 味药材配伍而成，具有滋补肝肾、益肝明目的功效，是中医治疗肝肾阴亏、视物昏花的临床经验方。方中菊花［1-3］、枸杞子［4-7］、黄芪［8-10］、当归［11-12］等药味中的酚酸、黄酮、生物碱抗炎、抗氧化活性良好，并且芹菜素、玉米黄素、黄芪甲苷等成分具有一定的视网膜保护作用［13-15］，但该制剂来源于临床，目前缺乏文献研究，有效物质尚不明确。

液质联用（LC-MS）技术具有分析范围广、检测限低、定性分析结果可靠等优点，故本实验采用UPLC-Q-TOF／MS法，对杞菊景明颗粒在大鼠血浆、胆汁、尿液、粪便中的代谢产物进行鉴定，以期为阐明该制剂药效物质基础及作用机制提供参考，也为进一步开发相关产品奠定基础。

1 材料

Waters ACQUITY UPLC 系统（配置四元泵溶剂系统、在线脱气机、自动进样器）、SynaptG2-s TOF 质谱仪（配置MassLynx 4.2 质谱工作站软件）（美国Waters 公司）；D2021 离心机、MX-S 涡旋混匀器［大龙兴创实验仪器（北京）有限公司］；ML204、MS105 电子分析天平［梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司］；Milli-Q 超纯水系统（美国Millipore 公司）。

阿魏酸（批号110773-201915，纯度≥99.4%）、咖啡酸（批号110885-201703，纯度≥99.7%）、绿原酸（批号110753-202018，纯度≥96.1%）、木犀草素（批号111520-202006，纯度≥94.4%）对照品均购自中国食品药品检定研究院；芒柄花素（批号F27J7S18516）、芹菜素（批号T04S8F43072）、芹菜素-7-O-β-D吡喃糖苷（批号Y20S6Y17404）、异牡荆素（批 号Y25A8H42502）、毛蕊异黄酮（批 号Y05J11H115098）、毛蕊异黄酮苷（批 号Y13F11H108672）对照品均购自上海源叶生物科技有限公司，纯度均≥98%。枸杞子、菊花、黄芪、茯苓、当归、石决明、山楂、益智仁、铁皮石斛均购自亳州市紫锐药业有限公司，经南京中医药大学严辉副教授鉴定为正品，均符合2020 年版《中国药典》 要求。甲酸、乙腈均为色谱纯，购自德国Merck 公司。

SPF 级雄性SD 大鼠，体质量200～220 g，由浙江省实验动物中心提供，动物生产许可证号SCXK（浙）2019-0001，饲养条件为温度20～25 ℃，相对湿度（45±10）%，12 h／12 h 光照／黑暗循环，自由进食饮水，实验前适应性饲养1 周。

2 方法

2.1 浓缩液制备 按处方配比称取颗粒组方药材共520 g，10 倍量30% 乙醇回流提取3次，每次1 h，合并提取液，减压浓缩至生药量1 g／mL，即得，在4 ℃下保存。

2.2 分组与给药 12 只大鼠随机分为空白组、给药组，每组6只，分别灌胃给予生理盐水、“2.1”项下浓缩液 ［蒸馏水稀释至0.5 g／mL，剂量为5.46 g／kg（临床等效量）］，每天1次，连续3 d。

2.3 生物样品采集

2.3.1 血浆 大鼠于末次给药前禁食12 h，自由饮水，于给药后0.5、1、2、4、6、8 h 眼眶丛静脉取血，置于预先加入10 μL 1%肝素钠的EP 管中，3 500 r／min 离心10 min，取上清，保存于-80 ℃冰箱中。

2.3.2 胆汁 大鼠于末次给药前禁食12 h，自由饮水，给药后麻醉，进行胆管插管手术，引流胆汁，每2 h 收集1次，持续10 h，保存于-80 ℃冰箱中。

2.3.3 尿液、粪便 大鼠于末次给药前禁食12 h，自由饮水，给药后置于代谢笼中，收集0～12、12～24、24～36 h 的尿液和粪便，保存于-80 ℃冰箱中。

2.4 供试品溶液制备

2.4.1 血浆 将不同时间点大鼠血浆等体积混合，取300 μL，加入900 μL 甲醇沉淀蛋白，涡旋30 s，4 ℃、13 000 r／min 离心10 min，取上清，浓缩，用50% 甲醇、0.1% 甲酸各50 μL 复溶，4 ℃、13 000 r／min 离心10 min，取上清，即得。

2.4.2 胆汁 将不同时间点大鼠胆汁等体积混合，取200 μL，加入200 μL 乙腈涡旋30 s，4 ℃、13 000 r／min 离心10 min，取上清，即得。

2.4.3 尿液 将不同时间点尿液等体积混合，取200 μL，加入200 μL 甲醇涡旋3 min，4 ℃、13 000 r／min 离心10 min，浓缩至干，200 μL 5%乙腈（含0.1% 甲酸）复溶，4 ℃、13 000 r／min离心10 min，取上清，即得。

2.4.4 粪便 将不同时间点粪便等质量混合，取1.0 g，加入3倍量50% 甲醇溶解，超声处理30 min，4 ℃、13 000 r／min 离心10 min，取上清液，即得。

2.5 UPLC-Q-TOF／MS 分析条件

2.5.1 色谱 ACQUITY UPLC BEH C18色谱柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm），流动相0.1% 甲酸（A）-乙腈（B），梯度洗脱（0～2 min，95%～87%A；2～4 min，87%～82%A；4～5 min，82%A；5～8 min，82%～80% A；8～9 min，80%～60% A；9～13 min，60%～35%A；13～15 min，35%～20%A；15～16 min，20%A～0）；体积流量0.4 mL／min；柱温30 ℃；进样量2 μL。

2.5.2 质谱条件 ESI 电喷雾离子源，正负离子模式；毛细管电压3.0 kV；离子源温度120 ℃；脱溶剂气温度400 ℃；锥孔电压30 V，体积流量50 L／h；脱溶剂气体积流量80 L／h，碰撞能量20～50 V；质量扫描范围m／z100～1 000。

2.6 数据处理 通过Metabolynx XS、Mass Frontier 7.0 软件进行处理，数据采集使用MassLynxTM v 4.2工作站，方式、模式分别为Centroid、碰撞能量梯度（MSE）；数据分析模式为质量亏损过滤（MDF）。

3 结果

3.1 UHPLC-Q-TOF／MS 分析 总离子流图见图1，将化合物可能的代谢方式输入MetaboLynx XS 软件，并将MDF 应用于数据处理，结合对照品及参考文献中的保留时间、一级、二级质谱信息，共发现30 种成分，其中原型成分10种，代谢产物20种。通过与对照品比对，确定原型成分分别为阿魏酸、咖啡酸、绿原酸、芹菜素、芹菜素-7-O-β-D吡喃糖苷、异牡荆素、木犀草素、毛蕊异黄酮、毛蕊异黄酮苷、芒柄花素。

图1 UHPLC-Q-TOF／MS 总离子流图Fig.1 UHPLC-Q-TOF／MS total ion current chromatograms

3.2 酚酸及其代谢产物鉴定 在生物样品中检测到阿魏酸、咖啡酸、绿原酸原型及其代谢产物，具体信息见表1，代谢途径见图2。以阿魏酸为例，其原型主要存在于大鼠尿液中，保留时间为3.12 min，准分子离子峰m／z193.049 1 ［M-H］-（C7H6O5），m／z178.028 5 为［M-OH］-，与对照品相符；代谢物A1-1 对应准分子离子峰m／z274.014 7 ［M-H］-，与阿魏酸准分子离子峰相差81，可能为阿魏酸硫酸酯化产物，其二级碎片m／z193.049 1、178.025 3与阿魏酸一致，m／z149.059 4 为阿魏酸脱去羧基，m／z134.035 7 为进一步脱去甲基产生的碎片离子；A1-2 准分子离子峰为m／z369.080 1 ［M-H］-，推断其分子式为C16H18O10，在二级碎片中裂解产生了m／z193.048 2、178.023 6、134.036 0 离子峰，与阿魏酸特征离子峰相同，可能为阿魏酸葡萄糖醛酸化产物。另外，阿魏酸主要进行Ⅱ相代谢反应（硫酸酯化、葡萄糖醛酸化），与文献［16］报道一致。

图2 阿魏酸（A1）、咖啡酸（A2）、绿原酸（A3）代谢途径Fig.2 Metabolic pathways of ferulic acid（A1），caffeic acid（A2）and chlorogenic acid（A3）

3.3 黄酮及其代谢产物鉴定 在生物样品中检测到芹菜素、芹菜素-7-O-β-D吡喃糖苷、异牡荆素、木犀草素、毛蕊异黄酮、毛蕊异黄酮苷、芒柄花素及其代谢产物，具体信息见表1，代谢途径见图3～4。以毛蕊异黄酮、毛蕊异黄酮苷为例，B5准分子离子峰m／z285.075 4 ［M-H］＋脱甲基形成m／z270.045 6 碎片离子峰，与毛蕊异黄酮对照品一致；B6 准分子离子峰m／z447.091 7 ［M-H］＋，二级碎片m／z285.075 2［M-C6H10O5］＋、271.059 1［M-C6H10O5-CH3］＋，与毛蕊异黄酮苷对照品一致；代谢物B5-1 准分子离子峰m／z301.072 5 ［M＋H］＋（C16H12O6），其二级碎片m／z286.049 0 ［M ＋HCH3］＋、153.019 2 ［M＋H-C9H8O2］＋与文献［17］报道一致，可能为毛蕊异黄酮羟基化产物；B5-2、B5-3 准分子离子峰m／z461.107 5、365.032 8［M＋H］＋，其特征离子峰m／z285.07、270.05 与毛蕊异黄酮苷相近，B5-2 比毛蕊异黄酮多176，可能为毛蕊异黄酮醛酸化产物，而B5-3 比毛蕊异黄酮多80，可能为毛蕊异黄酮醛酸化硫酸酯化产物；B5-4 准分子离子峰m／z447.091 9 比B10 少14，其二级离子碎片m／z271.059 6 为毛蕊异黄酮脱CH2特征峰，可能为毛蕊异黄酮脱甲基葡萄糖醛酸结合产物。另外，该类化合物在体内进行羟基化、还原等Ⅰ相代谢反应，以及甲基化、硫酸酯化、葡萄糖醛酸化等Ⅱ相代谢反应。

图3 芹菜素（B1）、芹菜素-7-O-β-D 吡喃糖苷（B2）、异牡荆素（B3）、木犀草素（B4）代谢途径Fig.3 Metabolic pathways of apigenin（B1），apigenin-7-O-β-D-glucopyranoside（B2），isovitexin（B3）and luteolin（B4）

4 讨论

本实验发现，杞菊景明颗粒吸收进入体内的主要成分是酚酸、黄酮。

4.1 酚酸 来源于当归、菊花的绿原酸、咖啡酸、阿魏酸代谢途径以甲基化、葡萄糖醛酸化、硫酸酯化等Ⅱ相代谢反应为主，而阿魏酸、咖啡酸及其代谢产物主要集中在大鼠尿液、粪便中，表明游离酚酸在胃中可被迅速吸收，主要通过尿粪排泄，与文献［18］报道一致。另外，在大鼠胆汁中也检测到酚酸代谢产物，表明肝脏也参与其体内代谢过程。

图4 毛蕊异黄酮（B5）、毛蕊异黄酮苷（B6）、芒柄花素（B7）代谢途径Fig.4 Metabolic pathways of calycosin（B5），calycosin-7-glucoside（B6）and formononetin（B7）

4.2 黄酮 来源于菊花的芹菜素、芹菜素-7-O-β-D吡喃糖苷、异牡荆素、木犀草素，以及来源于黄芪的毛蕊异黄酮、毛蕊异黄酮苷、芒柄花素主要代谢反应有羟基化、葡萄糖醛酸化、硫酸酯化结合等，以Ⅱ相代谢反应为主［19］，并且检测到多种来源于菊花的原型成分及其代谢产物，提示该药材可能是重要组成药味。芹菜素及其糖苷（芹菜素-7-O-β-D吡喃糖苷、异牡荆素）、木犀草素属于黄酮类，而毛蕊异黄酮、芒柄花素属于异黄酮类，芹菜素与木犀草素、毛蕊异黄酮与芒柄花素之间可通过羟基化和脱羟基实现相互转化［17］。该类化合物主要集中在大鼠胆汁、尿液中，表明肝脏、肠道是其代谢的主要场所，进入体内后一部分以原型直接吸收，进入体循环，最终于肝脏中代谢灭活；另一部分在小肠中经过肠道微生物的代谢转化，进而吸收参与体内循环［20-21］。另外，在大鼠血浆中鉴定出毛蕊异黄酮、木犀草素原型成分，表明杞菊景明颗粒入血成分以两者及其羟基化、硫酸酯化、葡萄糖醛酸化代谢产物为主。

4.3 其他成分 枸杞子中多糖结构复杂，质谱分析较困难；色素含量较低，在该条件下也难以检测。因此，本实验未能定位到该药材相关代谢成分，有待今后作进一步研究。