UPLC-MS／MS 法同时测定酸枣安神颗粒中15 种成分

2022-07-22李葆林郄兰霞王鑫国牛丽颖

中成药 2022年6期

李葆林郄兰霞王鑫国牛丽颖*

（1.河北中医学院，河北石家庄050091； 2.河北省中药配方颗粒技术创新中心，河北石家庄050091；3.中药材品质评价与标准化河北省工程研究中心，河北石家庄050091； 4.石家庄市第五医院，河北石家庄050024）

酸枣仁为鼠李科植物酸枣Ziziphus jujubaMill.var.spinosa（Bunge）Hu ex H.F.Chow 的干燥成熟种子，主产于河北、陕西、辽宁、河南等地，具有养肝、宁心、安神、敛汗之功效［1-3］，相关市售制剂达数十种之多。课题组前期自主研发了以酸枣仁为君药，配伍茯苓、桑葚、黄精、枸杞、佛手等药材的酸枣安神颗粒，优化了其处方及制备工艺，并建立了质控标准。本实验在此基础上，采用UPLC-MS／MS 法同时测定酸枣安神颗粒中柚皮苷、绿原酸、新绿原酸、隐绿原酸、异绿原酸A、异绿原酸B、异绿原酸C、槲皮素、异槲皮苷、紫云英苷、山柰酚、阿魏酸、咖啡酸、芹菜素、没食子酸的含量，以期为该制剂质量控制提供参考。

1 材料

1.1 仪器 LC-30A 型超高效液相色谱仪（日本岛津公司）；Q-Triple 4500 MS／MS System（美国AB SCIEX 公司）；TB-215D 电子天平（十万分之一）、BSA224S-CW 电子天平（万分之一）（德国赛多利斯公司）；KQ-250 型超声波清洗器（功率250 W、频率40 kHz）（昆山市超声仪器有限公司）。

1.2 试剂与药物绿原酸对照品（纯度99.96%，批号PY20170216）购自南京普怡生物科技有限公司；槲皮素（纯度97.3%，批号100081-200406）、异槲皮苷（纯度97.2%，批号111809-201804）、阿魏酸（纯度99%，批号110773-201614）、咖啡酸（纯度98%，批号110885-200102）、芹菜素（纯度99.6%，批号111901-201102）、没食子酸（纯度90.8%，批号110831-201605）对照品均购自中国食品药品检定研究院；柚皮苷（纯度98%，批号151009）、山柰酚（纯度98%，批号130708）对照品均购自成都普菲德生物技术有限公司；新绿原酸（纯度98%，批号MUST-12113001）、隐绿原酸（纯度98%，批号MUST-13013002）、紫云英苷（纯度98.81%，纯度MUST-16030810）对照品均购自成都曼斯特生物技术有限公司中国科学院成都生物研究所；异绿原酸A（纯度99%，批号DST-180130-037）、异绿原酸B（纯度99.05%，批号DST180130-037）、异绿原酸C（纯度99.84%，批号DST180210-038）对照品均购自成都德斯特生物技术有限公司。酸枣安神颗粒（自制，批号20200811、20200812、20200813）。乙腈、甲醇、甲酸为色谱纯；其他试剂均为分析纯；水为超纯水。

2 方法与结果

2.1 溶液制备

2.1.1 对照品溶液精密称取柚皮苷、绿原酸、新绿原酸、隐绿原酸、异绿原酸A、异绿原酸B、异绿原酸C、槲皮素、异槲皮苷、紫云英苷、山柰酚、阿魏酸、咖啡酸、芹菜素、没食子酸对照品适量，甲醇制成贮备液，吸取适量，置于10 mL 量瓶中，甲醇稀释至刻度，摇匀，即得（各成分质量浓度分别为8.32、56.06、14.72、12.45、2.20、1.02、1.71、6.23、11.13、3.65、4.17、71.71、2.13、0.52、3.98 μg／mL）。

2.1.2 供试品溶液取本品约0.5 g，精密称定，置于50 mL 具塞锥形瓶中，精密加入10 mL 甲醇，称定质量，超声提取15 min，冷却至室温，甲醇补足减失的质量，0.22 μm 微孔滤膜过滤，即得。

2.2 LC-MS 分析条件

2.2.1 色谱 Shim-pack GIST C18色谱柱（2.1 mm×100 mm，2.0 μm）；流动相乙腈（A）-0.1%甲酸（B），梯度洗脱（0～5 min，7% A；5～15 min，7%～45% A；15～20 min，45% A；20～33 min，45%～90%A；33～34 min，90%A；34.1～40 min，7%A）；体积流量0.4 μL／min；柱温35 ℃，进样量1 μL。MRM 色谱图见图1。

图1 各成分MRM 色谱图Fig.1 MRM chromatograms of various constituents

2.2.2 质谱电喷雾离子源（ESI），多反应监测（MRM），负离子模式；源喷射电压（IS）-4 500 V；离子源温度550 ℃；雾化气（GS1）50 psi（1 psi ＝6.895 kPa）；辅助气（GS2）50 psi；气帘气（CUR）40 psi，其他参数见表1。

表1 各成分质谱参数Tab.1 Mass spectrometry parameters for various constituents

2.3 线性关系考察将“2.1”项下对照品溶液逐级稀释2、4、10、20、200倍，在“2.2”项条件下进样测定。以对照品质量浓度为横坐标（X），峰面积为纵坐标（Y）进行回归，并分别以信噪比（S／N）10、3 为定量限（LOQ）、检测限（LOD），结果见表2，可知各成分在各自范围内线性关系良好。

表2 各成分线性关系Tab.2 Linear relationships of various constituents

2.4 精密度试验取同一份稀释20 倍的对照品溶液，在“2.2”项条件下进样测定6次，测得柚皮苷、绿原酸、新绿原酸、隐绿原酸、异绿原酸A、异绿原酸B、异绿原酸C、槲皮素、异槲皮苷、紫云英苷、山柰酚、阿魏酸、咖啡酸、芹菜素、没食子酸峰面积RSD 分别为2.79%、2.09%、1.99%、1.98%、1.68%、1.94%、2.25%、2.88%、1.58%、2.27%、2.19%、1.62%、1.58%、2.78%、1.25%，表明仪器精密度良好。

2.5 稳定性试验取同一批本品，按“2.1.2”项下方法制备供试品溶液，于0、1、2、4、8、12、18 h 在“2.2”项条件下进样测定，测得柚皮苷、绿原酸、新绿原酸、隐绿原酸、异绿原酸A、异绿原酸B、异绿原酸C、槲皮素、异槲皮苷、紫云英苷、山柰酚、阿魏酸、咖啡酸、芹菜素、没食子酸峰面积RSD 分别为1.61%、1.84%、1.76%、2.25%、2.08%、1.74%、2.39%、2.64%、2.83%、2.29%、2.50%、1.88%、1.52%、2.33%、2.36%，表明溶液在18 h 内稳定性良好。

2.6 重复性试验取同一批本品，按“2.1.2”项下方法平行制备6 份供试品溶液，在“2.2”项条件下进样测定，测得柚皮苷、绿原酸、新绿原酸、隐绿原酸、异绿原酸A、异绿原酸B、异绿原酸C、槲皮素、异槲皮苷、紫云英苷、山柰酚、阿魏酸、咖啡酸、芹菜素、没食子酸含量RSD 分别为2.85%、1.93%、1.11%、2.19%、2.17%、2.59%、2.76%、2.01%、1.96%、2.83%、2.82%、2.56%、2.65%、2.89%、1.93%，表明该方法重复性良好。

2.7 加样回收率试验精密称取各成分含量已知的同一批本品约0.25 g，分别加入高、中、低水平对照品溶液，每个水平平行3份，共9份，按“2.1.2”项下方法制备供试品溶液，在“2.2”项条件下进样测定，计算回收率。结果，柚皮苷、绿原酸、新绿原酸、隐绿原酸、异绿原酸A、异绿原酸B、异绿原酸C、槲皮素、异槲皮苷、紫云英苷、山柰酚、阿魏酸、咖啡酸、芹菜素、没食子酸平均加样回收率分别为 98.90%、98.57%、100.66%、98.96%、98.63%、101.46%、98.81%、101.22%、98.26%、98.77%、102.68%、98.43%、97.92%、102.04%、98.78%，RSD 分别为1.90%、1.99%、2.57%、1.62%、1.52%、2.77%、1.20%、1.67%、1.43%、2.16%、2.29%、2.16%、2.33%、2.86%、2.47%。

2.8 样品含量测定取3 批样品，按“2.1.2”项下方法制备供试品溶液，在“2.2”项条件下进样测定，计算含量，结果见表3。

表3 各成分含量测定结果（μg／g）Tab.3 Results of content determination of various constituents（μg／g）

3 讨论

3.1 指标成分选择参照2020 年版《中国药典》及相关文献，课题组前期考察了斯皮诺素、芦丁、橙皮苷、木兰花碱、酸枣仁皂苷A、酸枣仁皂苷B、5-羟甲基糠醛、白桦脂酸、白桦脂醇、槲皮苷等31 种成分［4-20］，并且已采用HPLC 法测定了斯皮诺素、芦丁、橙皮苷、木兰花碱含量，发现介于0.114 9～0.297 8 mg／g 之间［21］。考虑到酸枣安神颗粒中各成分含量限度，结合方法学考察情况，最终选择15 种成分作为指标，其中柚皮苷、芹菜素来源于酸枣仁，绿原酸、新绿原酸、隐绿原酸、异绿原酸A、异绿原酸B、异绿原酸C、异槲皮苷、紫云英苷、没食子酸来源于桑葚，槲皮素、山柰酚来源于黄精，阿魏酸、咖啡酸来源于枸杞。

3.2 流动相选择本实验考察了甲醇-水、甲醇-0.1%甲酸、乙腈-水、乙腈-0.1% 甲酸，发现以乙腈-甲酸洗脱时各成分分离度、峰形、出峰时间较好，故选择其作为流动相。