刘啸宇，后梦情，程安琪，胡传俊，姚 坤，吴 萧

（宿州学院生物与食品工程学院，安徽宿州 234200）

农杆菌介导法是目前转化双子叶植物最为广泛使用的方法之一，该方法简单，转化机制明确、周期短，同时因转入基因的拷贝数少，因此大大地降低了因同源抑制而产生基因沉默的可能性[1]。同时，该技术具有转育周期较短、遗传性状较为稳定、变异幅度较小、对农艺和经济性状干扰较少等特点，已成为我国农作物进行外源基因导入时最常用的技术手段[2-3]。但同时也面临一些重要的技术问题，如转化效率低和转化结果的未知性和不可控性等。为了进一步了解根癌农杆菌T-DNA 转运的分子机制，探讨是否可以通过提高T- 复合物招募蛋白VBP 在农杆菌细胞内的表达量来提高T-DNA 的转化效率，这在植物转基因方面的应用具有重要意义。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 所用菌株

Agrobacterium tumefaciensC58，E.coliDH5α，实验室保存，菌液与70%的甘油等体积保存在冻存管中，冻存于-75 ℃冰箱中。

1.1.2 所用质粒

Prset-a，具有T7 启动子，实验室保存；pegfp-n1，含有egfp基因的质粒，实验室保存；prset-agfp1，Atu4856 基因上游495 bp 序列，带上标记基因gfp，插入启动子已除去的prset-a 质粒，构建。

1.1.3 所用引物

所使用的引物信息（划线部分为酶切位点） 见表1。

表1 所使用的引物信息（划线部分为酶切位点）

1.2 试验方法

1.2.1 用聚合酶链式反应扩增带有标记基因的Atu4856启动子序列

（1） 扩增495 bp 的启动子序列。以Pv1、Pv2 为引物，BamHⅠ酶切位点在引物Pv1 上，配制反应体系进行PCR 反应，结束后，进行琼脂糖凝胶电泳，并回收产物[4-5]。

（2） 聚合酶链式反应扩增标记基因——gfp。以Pgfp2，Pg2 为引物，以质粒pegfp-n1 为模板，BamHⅠ酶切位点在引物Pg2 上，待反应结束后，回收PCR产物，步骤同1.2.1 步骤（1）。

（3） 扩增Atu4856 启动子带标记基因的全长序列。将1.2.1 中（1） （2） 步骤的产物混合，以Pv1 和Pg2 为引物，配置反应体系进行扩增[6-7]，产物回收，步骤同1.2.1 步骤（1）。

重叠延伸PCR 的过程和体系见图1，PCR 反应的体系见表2。

图1 重叠延伸PCR 的过程和体系

表2 PCR 反应的体系/μL

1.2.2 提取大肠杆菌prset- a 质粒

构建启动子探针载体的基本质粒prset-a 见图2。

1.2.3 PCR 扩增得到不含T7 启动子的prset- a 质粒

在T7 启动子基因序列的两端设计引物P1 和P2，均含有BamHⅠ限制性位点。同时，以prset-a质粒为扩增模板，从prset-a 质粒中去除T7 启动子，反应体系如表2 所述。PCR 反应结束后，PCR 产物回收步骤同1.2.1 步骤（1）。

1.2.4 DNA 的酶切、连接、转化及重组子的筛选

（1） 酶切以绿色荧光基因（gfp） 为报告基因的Atu4856 启动子序列。用BamHⅠ酶切含gfp的Atu4856 启动子序列。按照酶供应商提供的说明进行消化。按照表3 添加消化反应系统。消化反应体系置于37 ℃恒温水浴中水浴加热3 h。以非酶切序列为对照，用0.8%琼脂糖凝胶电泳鉴定酶产物，用试剂盒回收产物，并将其保存在-20 ℃条件下备用[8]。

酶切体系见表3。

表3 酶切体系/μL

（2） 去磷酸化和空载体酶切。用BamHⅠ酶切无T7 启动子prset-a 的PCR 产物。消化反应体系按表3混合，37 ℃下保温3.5 h。电泳后回收1% （m/V）琼脂糖凝胶，以防出现载体自连的现象[9]，将按照表4 中体系进行载体去磷酸化。

载体去磷酸化体系见表4。

表4 载体去磷酸化体系/μL

（3） 连接。按照表5 所示的连接体系，将BamHⅠ酶切后的目的序列用T4 DNA Ligase 连接到BamHⅠ酶切后并去除磷酸化的载体上，于4 ℃下过夜连接，用于转化。

连接体系见表5。

表5 连接体系/μL

（4） 转化。将连接产物转化大肠杆菌DH5α 感受态细胞。

（5） 重组子的筛选。挑取单菌落，用LB 培养基37 ℃下培养，提取质粒，接着用BamHⅠ酶切、鉴定[10]。将与目的条带大小相同的阳性克隆片段进行测序，命名含有Atu4856 启动子的重组质粒，即prsetagfp1，并将此菌种进行保存。

（6） 检测探针载体的转录活性。挑取单菌落，用LB 培养基培养，在对数生长期时，对菌液进行离心、沉淀清洗，制片，在放大倍数为×400 的倒置荧光显微镜下观察是否有荧光。

2 结果与分析

2.1 带有gfp 基因的Atu4856 启动子序列扩增

以pegfp-n1 质粒为模板，经PCR 特异性扩增获得大小约750 bp 的绿色荧光蛋白基因（gfp） （图2）。设计搭桥PCR 引物，通过重叠延伸PCR，将gfp基因连接到Atu4856 启动子序列（图3），形成大小约1 225 bp 的嵌合基因片段，作为其是否具有启动子基因转录活性的报告基因。

PCR 扩增gfp基因电泳图见图2，PCR 扩增带有gfp的Atu4856 启动子电泳图见图3。

图2 PCR 扩增gfp 基因电泳图

图3 PCR 扩增带有gfp 的Atu4856 启动子电泳图

2.2 PCR 扩增无T7 启动子的质粒（prset-a）

模板采用质粒prset-a，采用引物P1 和P2，通过PCR 扩增得到不含T7 启动子的质粒prset-a，大小约2.7 kb（图4），用于重组表达质粒的构建。

PCR 扩增去除T7 启动子的prset-a 质粒电泳图见图4。

图4 PCR 扩增去除T7 启动子的prset-a 质粒电泳

2.3 酶切鉴定prset-agfp1 重组质粒

将BamHⅠ酶切后带有绿色荧光基因（gfp） 的Atu4856 启动子连接在BamHⅠ酶切后的prset-a 载体上，该载体无T7 启动子，接着转化到DH5α 大肠杆菌，培养过夜。经过提质粒、酶切、琼脂糖凝胶电泳等一系列过程，验证与PCR 产物一致（图5），同时将质粒测序，测序结果表明prset-a 质粒上成功插入了标记基因（gfp） 的Atu4856 启动子序列，载体构建成功。

酶切鉴定prset-agfp1 重组质粒电泳图见图5。

图5 酶切鉴定prset-agfp1 重组质粒电泳图

2.4 验证Atu4856 启动子在探针载体中的活性

取菌液制片，在倒置荧光显微镜下观察。结果显示，发射蓝光时有荧光，而只带prset-a 载体的大肠杆菌没有荧光现象（图6）。说明与gfp基因融合的载体已被成功构建，带有荧光基因（gfp） 的Atu4856启动子序列被证明具有转录活性。

未突变的含有495 bp Atu4856 上游序列重组质粒E.coli（prset-agfp1） 的荧光观察结果见图6。

图6 未突变的含有495 bp Atu4856 上游序列重组质粒E.coli（prset-agfp1） 的荧光观察结果

3 结论

启动子是构建基因表达载体的重要因素，对外源基因的表达水平具有着重要的影响。查阅大量文献、进行理论分析和试验工作，通过PCR 方法，获得了编码VBP3 蛋白Atu4856 基因的全长启动子序列。将prset-a 载体的T7 启动子与GFP 基因重组后，用Atu4856 启动子序列取代，成功构建了能在大肠杆菌中表达的启动子探针载体，并利用荧光蛋白研究农杆菌Atu4856 基因在大肠杆菌中的表达调控机制。