薛宝玲，宋晓彬

（1. 内蒙古农业大学职业技术学院食品工程技术系，内蒙古包头 014109；2. 内蒙古乌兰察布市食品药品检验所，内蒙古乌兰察布 012000）

玉米作为一种重要的食品来源，也是全球第一大谷物[1]，营养丰富，堪称“五谷之首”，全世界约有30%以上的人选择玉米作为主食[2]。叶酸又称维M、维B9，叶酸是维B 复合体之一，有促进骨髓中幼细胞成熟的作用，可改善血管内皮功能、预防心血管疾病[3-4]。叶酸在玉米中含量较高，适用于叶酸缺乏人群有效补充叶酸。

目前，天然植物中叶酸检测的方法主要有微生物法和高效液相色谱法。高效液相色谱法的特点是测定结果准确、 操作简便、省时省力、分析速度快、分离效果好[5]，是近年来发展速度较快的测定叶酸的方法。目前，世界范围内利用高效液相色谱法来测定叶酸的产品范围比较广泛。而国内将其运用于检测血浆、保健食品等中叶酸比较多，用于果蔬中叶酸检测的报道甚少[6-8]。由于质谱仪高灵敏度的特性使其能够检测含量很低的样品，并在定性和定量分析方面表现出巨大的优势[9]，所以可以通过液质联用来测定叶酸。主要研究玉米在不同加工过程中叶酸稳定性的变化规律，为加工中营养成分的保持提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

新鲜的冷冻玉米，进行短暂的常温解冻，100 ℃沸水下煮制，待玉米籽粒有香气挥发时将玉米籽粒取出，液氮冻干机将玉米籽粒冻干，将干燥的玉米籽粒研磨成粉末，完全避光保存，待用。玉米籽粒真空包装进行加工，加工后放入-80 ℃下保存，冷却后拆开封口袋，按加工方式及对应的梯度分批次放入冻干机中研磨，避光干燥保存待用。

α - 淀粉酶，上海冠导生物工程有限公司提供；β - 巯基乙醇，山东三方化工集团提供；Na2HPO4·2H2O，NaH2PO4·2H2O，青岛永润化工科技有限公司提供；蛋白酶，上海翔陵化工有限公司提供；抗坏血酸钠盐，西安晋恒化工有限公司提供；甲醇、乙腈，天津市曾辉科技有限公司提供。

1.2 仪器与设备

ACCULAB ALC 型分析天平，梅特勒- 托利多仪器有限公司产品；pB-10 型pH 计，季尔国际贸易（上海） 有限公司产品；H2500R-2 型高速冷冻离心机，湘锐离心机仪器有限公司产品；水浴锅，西安科创实验室有限公司产品；DZF-603-A 型真空干燥箱，中国济南天宇专用设备有限公司产品；ZXZ-2 型真空泵，天津市泰斯特仪器有限公司产品；BC/BD-608 型冷柜，金坛讯生仪器有限公司产品；DTH40 型玉米膨化机，上海印溪仪器仪表有限公司产品；KQ-600DE 型超声波清洗器，上海光谱仪器厂产品；高效液相色谱仪，北京安捷伦有限公司产品；Arium 61316 型超纯水器，赛多利斯仪器厂产品。

1.3 试验方法

1.3.1 新鲜玉米粒提取

取新鲜的冷冻玉米，常温下解冻，在100 ℃沸水中煮制3~5 min，待玉米籽粒有香气挥发时将玉米籽粒取出，使用液氮冻干机将玉米籽粒冻干约24 h 左右，使用研磨仪磨成所需的玉米样品粉末（防止玉米样品在称取过程中受潮，造成试验误差），在干燥环境下分别称取5 份250 mg 玉米粉末样品，置于离心管封装、标记样品名称，完全避光保存待用。

分别取3 份20 g 玉米籽粒真空包装，封口后分别进行蒸制、煮制（不去掉真空包装袋）、微波的加工处理。加工过程中每种加工方式取5 份250 μg 玉米籽粒样品置于离心管中，分别进行的3 种加工方式，以加工时间为变量，蒸制使用蒸锅蒸1，2，3，4，5 min，水量为1.5 L，煮制使用电磁炉煮40 s，1 min，2 min，3 min，4 min 水量为1 L，微波加工使用微波炉微波10，20，40，50，60 s。加工后放入冰箱在-80 ℃下保存，冻干研磨离心，标记加工方式和时间梯度，避光干燥保存，待用。

1.3.2 玉米叶酸提取条件优化

在进行不同加工方法下叶酸含量变化探究试验之前，所需单因素条件不明确，需对提取过程中不同的单因素进行叶酸含量测定。在试验过程中，所有的样品都为非即时测定，需在-80 ℃下避光保存一段时间再进行测定。得出最优的各项单因素，从而可以优化测定条件，使不同加工方式下对即食玉米棒中叶酸含量的变化规律更加明显易得，同时降低试验误差，精确最后需要的试验数据。

单因素试验指标及用量见表1。

表1 单因素试验指标及用量

（1） 试验试剂。α - 淀粉酶溶液40 mg/mL，水溶；蛋白酶溶液2 mg/mL，水溶；试验用水，均为超纯水；每100 mL 提取液；β - 巯基乙醇200 μL；0.1 mol/L Na2HPO4·2H2O；0.1 mol/L NaH2PO4·2H2O；1×1=1 g 抗坏血酸钠盐；甲醇；乙腈。

（2） 试验方案。提取液：先配置0.1 mol/L 磷酸二氢钠，0.1 mol/L 磷酸氢二钠，若预配置100 mL 提取液，则先在烧杯中添加设定的抗坏血酸钠，再添加磷酸氢二钠适量，最后添加磷酸二氢钠，pH 计测定设定的pH 值，上述步骤完成，添加0.5 mL 的β -巯基乙醇，之后按如下步骤操作。

①取250 mg 玉米籽粒冻干粉于离心管中，加入5 000 μL 提取液涡旋振荡器振荡，使冻干粉与溶液充分混匀，100 ℃下加热10 min。②冰上迅速冷却，加入设定的α - 淀粉酶溶液，置于涡旋振荡器中振荡，使 α - 淀粉酶溶液与提取液充分混合，再置于金属浴加热振荡器上振荡30 min（37 ℃）。③加入设定的蛋白酶溶液，置于涡旋振荡器中振荡，使蛋白酶溶液与提取液充分混合，再置于金属浴加热振荡器上振荡60 min（37 ℃）。④取上清，加入设定的大鼠血清，金属浴加热振荡器振荡4 h 然后100 ℃加热10 min，冰上冷却10 min，离心处理（转速9 000 r/min，时间10 min）。⑤取上层清液，用0.22 μm 有机滤膜过滤，将滤液装入液相小瓶。

（3） 检测色谱。根据相关资料，检测色谱条件如下：①经HPLC 分析。测定标品在13.205 min 时出所需峰面积，所以大致在13 min 左右，将会得到试验所需的样品峰。②色谱条件。色谱柱：C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：A 为乙腈，B 为0.1 mol/L NaH2PO4溶液（0~5 min，5%；5~20 min，梯度上升到20%；20~30 min 保持30~40 min，5%乙腈；pH 值7.0）；流速1.0 mL/min；检测波长280 nm；进样量20 μL；柱温35 ℃。③HPLC 流动相。试验所需流动相为A：乙腈溶液500 mL，B：0.1 mol/L NaH2PO4溶液1 L。其中，0.1 mol/L NaH2PO4溶液需要在配制完成后进行超声去气泡溶解，抽滤装置上进行过膜净化，防止堵塞色谱柱；所有流动相溶液需现用现配。

（4） 叶酸含量计算。根据高效液相色谱法测定叶酸，根据标准品的叶酸含量和峰面积计算样品叶酸含量的公式。所测定标准品的峰面积和质量浓度分别为328.4，100 μg/mL，峰面积与质量浓度呈正比，所以得到公式：

高效液相色谱图见图1。

图1 高效液相色谱图

2 结果与分析

2.1 即食玉米棒叶酸提取单因素条件优化结果及分析

通过对即食玉米棒中测定叶酸的6 项单因素试验，根据每项单因素的用量和HPLC 测定含量结果进行单因素试验分析。

2.1.1 α - 淀粉酶对玉米棒中叶酸得率的影响

玉米含有大量的淀粉，α - 淀粉酶在提取液中的作用为酶解样品中多余的淀粉，减少试验误差。在提取温度为37 ℃，其他5 项单因素及相同加工条件（煮制） 不变的情况下，变化α - 淀粉酶用量。

α - 淀粉酶用量对提取玉米叶酸得率的影响见图2。

图2 α - 淀粉酶用量对提取玉米叶酸得率的影响

由图2 可知，在60，80，100，140，180 μL 的α - 淀粉酶用量5 个水平下，随着用量的增加，叶酸含量先增加再降低，在添加100 μL 时，叶酸含量达到最大值，随后叶酸含量开始下降，却定α - 淀粉酶的最佳用量为100 μL，即添加100 μL 质量浓度为40 mg/mL的α - 淀粉酶，表明该质量浓度下玉米籽粒粉末样品中的淀粉对叶酸含量测定的干扰最低。

2.1.2 蛋白酶对玉米棒中叶酸得率的影响

添加蛋白酶在提取液中可以酶解植物蛋白，保留叶酸。在提取温度为37 ℃，其他单因素及相同加工条件（煮制） 不变，变化蛋白酶用量。

蛋白酶用量对提取玉米叶酸得率的影响见图3。

图3 蛋白酶用量对提取玉米叶酸得率的影响

由图3 可知，在0，10，20，30，40 μL 用量5 个水平下，随着蛋白酶用量的增加，叶酸得率先增加再降低再增加，在添加质量浓度为2 mg/mL 的蛋白酶20 μL 后，叶酸含量开始下降。确认20 μL 蛋白酶为最佳用量，在该用量下，样品中的蛋白对叶酸含量的干扰最低。

2.1.3 大鼠血清对玉米棒中叶酸得率的影响

大鼠血清在提取过程中起到酶解（轭合酶） 的作用。试验在提取温度为37 ℃，其他5 项单因素及相同加工条件（煮制） 不变的情况下，变化大鼠血清用量。

大鼠血清用量对提取玉米叶酸得率的影响见图4。

图4 大鼠血清用量对提取玉米叶酸得率的影响

由图4 可知，在0，35，70，150，200 μL 用量5 个水平下，随着用量的增加，叶酸含量先增加再降低，在添加大鼠血清70 μL 后，叶酸含量开始下降，提取过程中添加大鼠血清70 μL 为最佳用量，此时大鼠血清在提取液中的酶解效果最好。

2.1.4 β - 巯基乙醇对玉米棒中叶酸得率的影响

由于叶酸对光和热不稳定，而在提取过程中样品及提取液有时会处于不完全避光和热不稳定的物理条件下，β - 巯基乙醇在提取过程中的作用是为了保护叶酸稳定性，防止叶酸降解及流失。对即食玉米棒提取叶酸时，提取温度为37 ℃，其他5 项单因素及相同加工条件（煮制） 不变的情况下，变化β -巯基乙醇用量。

β- 巯基乙醇对提取玉米叶酸得率的影响见图5。

图5 β - 巯基乙醇对提取玉米叶酸得率的影响

由图5 可知，在100，300，500，700，1 000 μL用量5 个水平下，随着β - 巯基乙醇用量的增加，叶酸含量先增加再降低，在添加500 μL 后，叶酸含量开始下降。因此，β - 巯基乙醇在提取过程中500 μL为最佳用量，此时β - 巯基乙醇对叶酸的保护效果最好。

2.1.5 pH 值对玉米棒中叶酸得率的影响

在提取温度为37 ℃，其他5 项单因素及相同加工条件（煮制） 不变的情况下，变化pH 值即提取液的酸碱环境。

pH 值对提取玉米叶酸得率的影响见图6。

图6 pH 值对提取玉米叶酸得率的影响

由图6 可知，在提取液pH 值为5.0，6.5，7.0，7.5，8.0 这5 个水平下，随着pH 值的增加，叶酸得率先增加再降低，弱碱性下（pH 值＞7.0） 叶酸得率较高；当pH 值为7.5 时，叶酸含量开始下降，所以叶酸在提取过程中的提取环境酸碱度pH 值7.5 时为最佳提取液酸碱度，叶酸在弱碱性环境下的HPLC提取含量最高。当流动相的有机相比例和pH 值偏酸性时，叶酸的保留时间越长，得到的色谱峰形较差，而且低pH 值也会影响叶酸的稳定性。

2.1.6 抗坏血酸盐对玉米棒中叶酸得率的影响

在抗氧化的单因素试验中，考虑到试验成本、抗氧化效果，以及提取体系下叶酸的最适酸碱度为弱碱性，选择抗坏血酸盐（抗坏血酸钠） 作为抗氧化剂。即在提取温度为37 ℃，其他5 项单因素及相同加工条件（煮制） 不变的情况下，变化抗坏血酸盐用量。

抗坏血酸盐对提取玉米叶酸得率的影响见图7。

图7 抗坏血酸盐对提取玉米叶酸得率的影响

由图7 可知，抗坏血酸盐在0.25，0.50，1.00，1.50，2.00 g 这5 个用量水平下，随着用量的增加，叶酸得率先增加再降低，在添加1.00 g 后，叶酸得率开始下降，所以抗坏血酸盐在该梯度下，提取过程中添加1.00 g 抗坏血酸盐为最适量，对叶酸保护效果较好。

为了试验结果的准确性，需要在提取叶酸的提取液中加入去除淀粉、植物蛋白、防止叶酸氧化及稳定叶酸结构的物质，在称取α - 淀粉酶、蛋白酶、大鼠血清、pH 值、抗坏血酸盐、β - 巯基乙醇时尽量统一称取，较少试验误差。在操作过程中，尽可能在低温和避光的环境下进行，对于试验所用到的容器，也尽量使用棕色瓶，试验过程中也可以通过使用封口膜来防止样品有杂质混入或者温度升高。在纯化样品过程中，加入适量的β - 巯基乙醇，能很好地保护5- 甲基四氢叶酸，尽可能减少损失。

在α - 淀粉酶、蛋白酶、大鼠血清、pH 值、抗坏血酸盐、β - 巯基乙醇这6 种单因素下，计算出这6 项单因素的最优叶酸含量分别16.45，16.72，18.25，16.95，16.39，16.39 μg/μL。

叶酸提取优化条件见表2。

表2 叶酸提取优化条件

由表2 可知，大鼠血清的最优用量对叶酸的保护效果较好，所得峰面积较大，测定的叶酸含量较高，单因素中以pH 值影响较小，所以确定在保护叶酸的试验中，优先使用大鼠血清作为样品轭和酶。

2.2 不同加工方法下叶酸的提取结果及分析

应用单因素确定的最优条件3 种不同加工方式进行不同方式下叶酸的测定，对比3 种加工条件下的叶酸含量，确定何种加工方式下叶酸的稳定性更佳。

不同加工方式测定结果见表3。

表3 不同加工方式测定结果

由表3 可知，蒸制即食玉米棒中提取出的叶酸含量为22.73 μg/μL，明显高于煮制、微波的加工方法，蒸制为最优加工方式。对比其他3 种加工方式，在6 项单因素完全相同的提取液中，避光操作试验下，叶酸含量呈现蒸制3 min ＞微波40 s ＞煮制2 min。

3 结论

通过单因素试验，结合对比3 种不同加工方式下提取即食玉米棒中叶酸含量试验中出现的问题。

通过单因素试验结合对比3 种不同加工方式来优化即食玉米棒中叶酸的提取工艺，确定叶酸在何种单因素和加工方式下更加稳定。在叶酸的提取过程中，α - 淀粉酶、蛋白酶、大鼠血清、β - 巯基乙醇、pH 值、抗坏血酸盐经过HPLC 测定后得出的最优条件为100，30，70，500 μL；pH 值7.5，1 g。对叶酸得率的影响程度为蒸制3 min，加工测定的叶酸含量22.73 μg/μL＞微波40 s 加工测定的叶酸含量19.76 μg/μL＞煮制2 min 加工测定的叶酸含量17.57 μg/μL。结果表明，煮制的条件下叶酸的损失率较大。