梁高华　钟敬祥

[专家介绍]钟敬祥，教授，主任医师，眼科学博士，博士生导师，博士后联合培养导师。现为暨南大学附属第一医院副院长，暨南大学临床医学研究院常务副院长。长期从事干细胞治疗、基因治疗在眼科的临床转化应用研究、白内障及角膜相关研究。现任亚洲干眼协会中国分会委员、广东省医学会眼视光与近视防控学分会主任委员、广东省医师学会眼科分会副主任委员;广东省中西医眼科学会副主任委员;亚太区屈光手术协会委员;卫生部眼内镜评审委员会委员;广东省眼科学会委员;广东省防盲学会常委;广东省眼耳鼻喉创伤学会委员;广东省医师协会理事。在国内外期刊共发表学术论文100余篇（包括SCI）。先后承担国家自然科学基金项目、国家重点基础研究发展计划项目、国家科技支撑计划项目及广东省自然科学基金项目等多项科研课题。先后荣获2015年羊城好医生、2016年广东医院优秀管理干部、2017年岭南名医、2017年暨南大学学位与研究生教育先进个人等称号。《中华现代眼科杂志》常务编委、《眼科新进展》编委、《广东医学》特邀审稿委员。

【摘要】外泌体是细胞外囊泡的一个子集，直径为40～160 nm（平均100 nm）的生物活性分子，包括蛋白质、遗传物质（如mRNA、microRNA和DNA）、脂质、糖和细胞环境相关的结合物，存在于细胞外液如血液、脑脊液、唾液、泪液、眼房水等体液中，可介导细胞通讯、细胞分化、细胞废物管理、免疫调节和新血管形成等多种生物功能。随着外泌体研究的深入及个性化治疗的迅猛发展，将外泌体研究扩展到眼部疾病迅速成为研究的焦点。

【关键词】外泌体;眼病;生物学标志物

中图分类号：R771文献标志码：ADOI：10.3969/j.issn.1003-1383.2022.06.001

Research progress of the exosomes as biomarkers for eye diseases

LIANG Gaohua ZHONG Jingxiang

（1. Department of Ophthalmology， Affiliated Hospital of Youjiang Medical University for Nationalities， Baise 533000， Guangxi， China;

2. Department of Ophthalmology， First Affiliated Hospital of Jinan University， Guangzhou 510630， Guangdong， China）

【Abstract】  Exosome， as a subset of extracellular vesicles， is a kind of bioactive molecules with diameters of 40 to 160 nm （average 100 nm）， containing proteins， genetic materials （such as mRNA， microRNA and DNA）， lipids， sugar， and cell environment-related conjugates. It exists in extracellular fluids such as blood， cerebrospinal fluid， saliva， tears， and aqueous humor， etc.， and can mediate a variety of biological functions such as cell communication， cell differentiation， cell waste management， immunoregulation， and neovascularization， etc. With the deepening of exosome research and the rapid development of individualized treatment， the extension of exosome research to eye diseases has rapidly become the focus of research.

【Key words】exosomes; eye diseases; biomarkers

外泌體是细胞外囊泡的一个子集，直径为40～160 nm（平均100 nm）的生物活性分子，包括蛋白质、遗传物质[如mRNA、microRNA（miRNA）和DNA]、脂质、糖和细胞环境相关的结合物，存在于细胞外液如血液、脑脊液、唾液、泪液、眼房水等体液中，可介导细胞通讯、细胞分化、细胞废物管理、免疫调节和新血管形成等多种生物功能。随着外泌体研究的深入及个性化治疗的迅猛发展，将外泌体研究扩展到眼部疾病迅速成了研究的焦点。本文主要对眼病的外泌体生物学标志物的研究进展，以及未来研究领域进行综述。

1外泌体概述及其生物学特征

外泌体是在细胞外分泌，从细菌到人类的整个进化过程中都存在[1]，是具有双层磷脂结构特征及与细胞具有相同的拓扑结构的膜结合体（双膜囊泡）。到目前为止，共鉴定出与外泌体相关的9769个蛋白质、3408个mRNAs、2838个miRNAs和1116个脂质（http：//www.exocarta.org/），进行细胞交换、免疫调节、生物分子转运和生理调节等胞内外信息交换作用[2～3]。外泌体中的生物分子成分因其来源细胞的类型和生理状态不同而表现出不同生物功能，这使它们成为一种有吸引力的生物标志物，可以为我们提供一种动态方法来提高对疾病病理生物学的理解、预测疾病进展和免疫反应治疗。

1.1信号转导功能信号转导是外泌体最基本、最重要的生物学功能。早期研究报告称，外泌体可能是以细胞垃圾载体来排出细胞中的代谢废物[4]。外泌体可以实现细胞间信号传导，从而调节各种生理和病理过程，还可以将信息传输到多个单元和位置，而不需要自分泌、旁分泌和细胞间直接接触的经典途径。外泌体还可以通过内吞作用将其货物转移到受体细胞，从而改变细胞状态并产生功能效应[5]。外泌体的摄取能力取决于受体细胞的类型而不是供体细胞的类型，这可能与器官特异性转移密切相关[6]。因而，需要进一步研究来了解外泌体信号转导的特定细胞和分子基础。

1.2免疫调节功能外泌体在免疫学中的作用已被广泛研究。B淋巴细胞衍生的外泌体通过主要组织相容性复合物（MHC）蛋白（MHC-Ⅰ和MHC-Ⅱ）执行抗原呈递[7]。癌细胞和免疫细胞一样，可以产生免疫活性外泌体，影响免疫调节机制。虽然外泌体免疫调节作用的研究主要集中在癌症疾病上，但近年来也研究了外泌体在眼部疾病中的免疫调节潜力[8]。需要更进一步研究外泌体在免疫介导的眼病中的作用。

1.3修复再生功能外泌体包含着特定成分在各种疾病模型中修复和再生发挥重要作用。干细胞来源的外泌体能够将特定成分（mRNA、miRNA和蛋白质）转移到靶细胞或损伤部位来诱导血管生成和促进损伤后修复[9]。此外，来自间充质干细胞（MSCs）的外泌体通过促进迁移和增殖、增强基质合成、减少细胞凋亡和调节免疫反应来参与损伤的修复和再生[10]。同样，外泌体促进再生的能力已在眼病模型中得到验证。RPE细胞内经受氧化应激的外泌体显示VEGFR-1和VEGFR-2的表达增加以及增强在内皮细胞中的血管生成能力[1]。数据表明，外泌体可能是MSCs的一个令人信服的替代品，将有助于避免使用鲜活MSCs-based治疗所涉及的大多数问题[11]。

1.4作为生物学标志物外泌体具有作为多种疾病的生物标志物的潜力。研究发现，在健康个体和患有各种疾病的患者之间，外泌体的数量和外泌体中的特定生物活性物质存在显著差异[12]。 外泌体也存在于与眼部密切相关的体液中，如房水（AH）[13]和玻璃体液（VH）[14]。外泌体的定向蛋白质组可以揭示RPE单层的极性特异性功能[15]。来自年龄相关性黄斑变性（AMD）、息肉状脉络膜血管病变（PCV）和视网膜中央静脉阻塞（CRVO）相关研究显示，所有这些患者AH中的特异性蛋白升高，提示AH中的外泌体蛋白可作为AMD诊断的生物标志物[16]。此外，AMD的主要病变部位RPE细胞的基底侧可释放外泌体也是诊断视网膜疾病的潜在生物标志物[17]。同样，作为眼科疾病诊断的特异性标志物的外泌体及其RNA有效载体的潜力在最近引起了人们的广泛关注。AH含有特征性的外泌体RNA，这可能为开发用于疾病诊断的外泌体提供重要的基础信息[18]。

诚然，外泌体由于其结构组成、多样化的生物学功能和独特的生物学来源而带来了广泛的研究及应用领域，且外泌体在健康个体及疾患个体上均有不同表达，估计在信号转换、免疫调节、修复、抗炎、药物载体、氧化应激中显示了其独特的生物标志物作用，因此，越来越多的研究焦点集中在外泌体的治疗作用，眼球是一个极其敏感的器官，随着外泌体在眼病研究中的深入，外泌体在前后节眼病的作用机制是一个值得关注的问题。

2眼部疾病的外泌体生物学标志物

近年来，利用外泌体和其他EVs识别疾病生物标志物的兴趣呈指数级增长，很容易理解为什么基于外泌体的诊断分析的开发潜力如此巨大。外泌体凭其独有的特征，成为寻找新生物标志物的理想靶点：（1）脂质双层保护外泌体内的RNA、DNA和蛋白质免受细胞外环境中的核酸酶和蛋白酶的影响;（2）外泌体包含组织、细胞或疾病特异性蛋白质和核酸;（3）外泌体的相对耐寒性可以使用多种方法从一系列体液（即血浆、血清、尿液、唾液、泪液、房水和脑脊液）中分离和富集。外泌体生物标志物在癌症、心血管疾病和糖尿病研究领域的应用前景[19～21]促进了眼部疾病外泌体生物学标志物的研究。

2.1泪液从理论上讲，泪液中眼病外泌体生物标志物的鉴定和表征具有很大的潜力。特别吸引人的是收集泪液的无创性质，但一个潜在的缺点是可以收集的体积相对较小。迄今为止，泪液作为外泌体生物标志物的来源尚未得到广泛研究，我们在Pubmed搜索发现关于研究泪液中外泌体标志物的文献甚少。泪液的蛋白质组学生物标志物研究已经确定了许多蛋白质（如膜联蛋白和热休克蛋白）与外泌体相关，尽管并未就此进行深入研究[22～23]，但随着外泌体分离技术、蛋白质鉴定方法和核酸测序的最新进展，泪液源性外泌体生物标志物的诊断和治疗潜力将是一个广泛开放的研究领域。

2.2房水AH已被用于各种眼病的蛋白质、核酸和脂质生物标志物分析[24～26]。一些最常见的眼部疾病，例如青光眼[27～28]、AMD[29～30]、糖尿病相关眼病[31～32]和葡萄膜炎[33～34]等研究了AH中的生物标志物含量。尽管绝大多数核酸和脂质生物标志物，以及在AH中鉴定的一些蛋白质生物标志物很可能与外泌体相关，但很少有人关注外泌体特异性生物标志物。已有研究将EVs从AH中分離出来。例如，DISMUKE等首先证明外泌体是AH中主要的EVs类型，并含有特征性外泌体RNA，这可能为开发用于疾病诊断的外泌体提供重要的生物标志物[35]。外泌体的定向蛋白质组可显示RPE单层的极性特异性功能[15]。有实验室进行了几项研究，重点关注AH中的外泌体及其在青光眼中的潜在作用，其中一项专门针对生成可用于识别外泌体生物标志物的数据[35]。最后，目前尚不清楚从RPE、Müller细胞、血管内皮细胞或其他视网膜细胞释放的外泌体或其他小型EVs是否可以进入AH。为了帮助回答这个问题并可能识别新的AH外泌体生物标志物，需要对这些细胞类型在体外释放的外泌体的组成进行基本表征。有正在进行的研究旨在仔细表征从RPE释放的外泌体和其他EVs[15]，可用作识别和验证AH中潜在外泌体生物标志物的资源。总之，未来关注AH眼病的外泌体生物标志物的研究必须利用适当的外泌体特异性方法进行分离;并且非常需要表征来自几种不同视网膜细胞类型的外泌体的蛋白质和核酸组成。

2.3玻璃體液在玻璃体手术、常规抗VEGF和抗PDGF注射可以获取VH，而不会让患者感到更多不适。因此，如果可以识别和验证强大的玻璃体外泌体生物标志物，那么它们的实际用途可能是巨大的。VH很有可能包含诸如AMD、萎缩型视网膜病变、糖尿病视网膜病变、青光眼和许多其他视网膜病变等疾病的特异生物标志物。在蛋白质组学、核酸和脂质组学方法的研究确定了视网膜静脉阻塞[36]、AMD[37]、糖尿病视网膜病变[38]和原发性开角型青光眼[39]中发现有趣的潜在玻璃体生物标志物。然而，这些研究都没有探索或讨论外泌体在VH中生物标志物的运输和存在中的作用。在这些研究中发现的一些生物标志物，例如AMD中的PED[40]和糖尿病视网膜病变中的角蛋白-1及PEDF[41]是与外泌体相关的蛋白质。外泌体特异性方法识别相关生物标志物的前景部分在于可以实现的特异性，而不是引用研究中使用的全局方法。对玻璃体中的蛋白质进行蛋白质组学鉴定，其中包含与外泌体相关的蛋白质和非外泌体相关蛋白质的混合物，有可能掩盖任一部分疾病相关蛋白质的相关性。因此，通过专门分离EVs可以去除可溶性（非外泌体/EVs相关的）蛋白质，并避免潜在的混淆结果。在迄今为止的几项研究中可以看到这种潜力显示，将玻璃体内的EVs作为疾病生物标志物的来源[14，29，42]。

2.4血液血液成分，如血浆和血清，可能是在眼病中识别外泌体生物标志物的最有前途的体液。这在很大程度上是由于：（1）标本收集比AH和VH更容易且侵入性更小;（2）可以收集更大的体积。使用血液作为眼外泌体来源的一个缺点可能是，这些外泌体可能只占全身循环中外泌体总量的一小部分，因此难以检测和分析。为了从血液中成功识别和分离眼部外泌体或小型EVs，对在健康和病理条件下从眼细胞释放的外泌体进行基本描述性表征是必不可少的。一旦确定了眼部细胞特异性的外泌体相关标志物，它们就可用于将眼外泌体与血液中存在的大量非眼EVs中分离出来。如果没有针对眼外泌体的富集步骤，开发基于血液的眼病生物标志物的任务可能是站不住脚的。目前，有基于免疫亲和性的商业试剂盒可用于直接从人血浆和血清中分离外泌体（Diagenode、MBL International和System Biosciences），支持这种方法的可行性。然而，在许多情况下，如果样本来自人类以外的其他物种（因为大多数商业试剂盒仅针对人类样本开发），或者如果不是商业提供的目标，则在许多情况下仍然需要开发和验证内部免疫亲和方法套件的重要性。最近，一种被称为“液体活检”的新的诊断概念出现了，预示着肿瘤微创基因特征的巨大潜力。目前研究支持血液循环肿瘤细胞（CTCs）、循环肿瘤DNA（ctDNA）、miRNA和外泌体作为葡萄膜黑色素瘤（UM）的生物标志物的可能性证据[43～44]。特别是这些生物标志物有在UM患者管理过程中帮助临床决策的潜力。该研究代表了一个令人鼓舞的概念验证，用于识别体循环中眼病特异性生物学标志物。

3小结与展望

虽然我们对外泌体在癌症中及其他领域中的作用已经了解很多，但外泌体在许多眼部特殊组织中的功能才刚刚开始进行严格的研究。多项研究为外泌体在眼病的病理过程中发挥重要作用提供了证据，包括炎症、神经元变性、氧化应激和新生血管形成。此外，外泌体具有跨越生物屏障的能力，可作为生物标志物或治疗载体，可能为眼病患者带来新的希望。然而，基于外泌体的复杂性和多样性，外泌体在眼科疾病中的功能和机制还需要进一步研究，尤其是其作为生物标志物或治疗载体方面的研究。因此，在眼科疾病中发展眼部体液源性外泌体生物标志物及治疗方案需要大量的研究，拥有广阔的研究及应用前景。参考文献[1] LI S F，HAN Y，WANG F，et al.Progress in exosomes and their potential use in ocular diseases[J].Int J Ophthalmol，2020，13（9）：1493-1498.

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