黄冰　张岩　杨光宇　李文学

【摘要】目的 觀察3，3'-二吲哚甲烷（3，3’-diindolylmethane， DIM）对Lieber-DeCarli标准型（regular型）酒精液体乙醇饲料（LD饲料）诱导的小鼠酒精性脂肪肝的改善作用，并对其分子作用机制进行初步探讨。方法将40只6～8周龄雄性C57BL/6J小鼠随机分为4组：正常对照组、酒精组、DIM（50 mg/kg）组和酒精+DIM（50 mg/kg）组，实验结束后称重，处死小鼠，收集血液和肝脏组织，分离血清测定肝功能指标，油红O染色观察肝脏的脂肪蓄积，Western blot检测内质网应激通路蛋白的表达。结果与对照组相比，DIM对肝脏没有显著的影响，四组之间体重无显著变化。与酒精组相比，DIM处理组血清中谷丙转氨酶（ALT）和谷草转氨酶（AST）水平显著降低（P<0.05），油红O染色和甘油三酯测定显示肝脏甘油三酯含量显著降低（P<0.05） 。DIM明显减轻肝脏脂肪变性，Western blot结果表明DIM能够抑制酒精诱导的内质网通路的关键蛋白PERP、eIF和CHOP的激活作用。结论DIM对小鼠酒精性脂肪肝具有一定的保护作用，其机制可能与抑制酒精激活的内质网应激通路有关。

【关键词】酒精性脂肪肝;3，3'-二吲哚甲烷;内质网应激;Lieber-DeCarli标准型饲料

中图分类号：R575.5文献标志码：ADOI：10.3969/j.issn.1003-1383.2022.06.004

Effect of 3，3'-Diindolylmethane on improving alcoholic fatty liver

through inhibiting endoplasmic reticulum stress in hepatocytes

HUANG Bing， ZHANG Yan， YANG Guangyu， LI Wenxue

（Department of Toxicological and Biochemical Laboratory， Guangzhou Center for

Disease Control and Prevention， Guangzhou 510440， Guangdong， China）

【Abstract】ObjectiveTo observe the effect of 3，3'-diindolylmethane （DIM） on improving the alcoholic fatty liver of mice induced by Lieber-DeCarli standard （regular type） alcoholic liquid ethanol feed （LD feed） and preliminarily discuss its molecular mechanism of action. Methods40 male C57BL/6J mice aged 6-8 weeks were randomly divided into 4 groups： normal control group， alcohol group， DIM （50 mg/kg） group and alcohol + DIM （50 mg/kg） group. After the experiment， the mice were weighed and then killed， and their blood and liver tissues were collected; serum were separated to determine the liver function indexes， and liver tissue were stained with oil red O to observe the fat accumulation in liver; Western blot was employed to detect the protein expression of endoplasmic reticulum stress pathways. ResultsCompared with the normal control group， DIM had no significant effect on the liver， and there was no significant change in body weight among the four groups. Compared with the alcohol group， the levels of alanine transferase （ALT） and aspartate transferase （AST） in the serum of DIM group were significantly decreased （P<0.05）， and oil red O staining and triglyceride determination showed that the content of liver triglyceride was decreased significantly （P<0.05）. DIM significantly reduced the hepatic steatosis. Western blot results showed that DIM could inhibit the alcohol-induced activation of key proteins PERP， eIF and CHOP in the endoplasmic reticulum pathways. ConclusionDIM has a certain protective effect on the alcoholic fatty liver in mice， and its mechanism may be related to the inhibition of alcohol-activated endoplasmic reticulum stress pathways.

【Key words】alcoholic fatty liver; 3，3'-diindolylmethane; endoplasmic reticulum stress; Lieber-DeCarli standard feed

酒精性肝病（alcoholic liver disease， ALD）是由于长期过度摄入酒精而导致的一系列慢性肝脏损伤为特征的疾病。初期阶段表现为酒精性脂肪肝（alcoholic fatty liver disease，AFLD），随着病程的进展进一步演变为酒精性肝炎、酒精性肝纤维化、酒精性肝硬化，最终可能发展为酒精性肝癌[1]。研究发现内质网应激（endoplasmic reticulum stress， ERS）在酒精性肝病发生和发展过程中起重要作用，在酒精暴露的小鼠肝脏中，检测到多种未正确折叠的蛋白，此外酒精引起的氧化应激也进一步诱导了内质网应激，内质网应激激活后诱导的细胞凋亡在肝细胞损伤中起着重要的作用[2～5]。因此，设计抑制内质网应激激活成为寻找防治AFLD发生发展的一个方向。

吲哚-3-甲醇（indole-3-carbinol， I3C）是一种从十字花科蔬菜如萝卜、芹菜、花椰菜等中提取而得的植物化学物，具有多种生物学功能[6～7]。3，3’-二吲哚甲烷（3，3’-diindolylmethane， DIM）是I3C在胃酸等酸性条件下发生低聚而得到的二聚物，其生物效应比I3C更强，在抗癌和缓解内质网应激方面已在体内和体外实验中得到证实[7～9]。然而对于酒精性脂肪肝，DIM是否能够抑制酒精诱导的内质网应激作用而改善酒精性脂肪肝尚未见报道。因此本研究采用液体酒精饲料构建酒精性肝病的模型，观察DIM对酒精致肝细胞损伤的拮抗作用，并初步探讨其作用机制，以期为预防和治疗提供新的理论依据。

1材料与方法1.1动物和饲料6～8周龄雄性C57BL/6J小鼠共40只，购自广东省医学实验动物中心，体重在20～22 g，饲养在SPF动物房中，室温22～25 ℃，相对湿度55%～60%，12 h的昼夜更替。Lieber-DeCarli酒精液体饲料购自南通特洛菲饲料科技有限公司，饲料中酒精热量36%（酒精含量：5%，wt/V，g/100 mL），脂肪35%，蛋白质18%，碳水化合物11%，酒精36%。酒精对照饲料脂肪35%，蛋白质18%，碳水化合物47%。DIM购自Sigma公司（美国），甘油三酯试剂盒购自南京建成生物公司（中国），抗体购自Cell Signaling Technology公司（美国）。

1.2酒精性肝病动物模型构建小鼠随机分为4组，①正常对照组：每天给予对照液体饲料（不含酒精）;②酒精组：给予Lieber-DeCarli（LD）酒精液体饲料;③DIM 50 mg/kg组;④ DIM+LD饲料组。DIM灌胃给药，连续给药4周。各组小鼠造模期间每天观察精神活动、反应能力、毛色等一般状态。造模结束，称重麻醉采血，离心取血清，肝脏称重分装。部分肝脏用4%多聚甲醛固定，剩余保存于-80 ℃冰箱备用。

1.3肝功能的检查取血清按试剂盒说明书方法测定血清谷丙转氨酶（ALT）、谷草转氨酶（AST），采用甘油三酯检测试剂盒检测甘油三酯。

1.4油红O染色取肝脏相同部分用4%多聚甲醛固定，冰冻切片，油红O染色，显微镜下观察其甘油三酯含量。

1.5Western blot于冰上提取组织蛋白，BCA试剂盒测定各样本蛋白浓度，蛋白煮沸变性后上样，10%聚丙烯酰胺凝胶电泳，用湿性转膜法将蛋白转移至PVDF膜上。含5%脱脂奶粉的TBST封闭2 h后分别用一抗稀释液稀释的抗体4 ℃孵育过夜，洗膜3次，加入二抗稀释液稀释的辣根过氧化酶标记的二抗，室温孵育2 h，洗膜3次后加入化学发光液，采用成像系统自动曝光。

1.6统计学方法采用SPSS 20.0软件对各项指标进行统计分析。服从正态分布的实验数据以均数±标准差描述。两组之间各种数据采用Student’s t-test检验（独立样本）或单因素方差分析（ANOVA），检验水准：α=0.05，双侧检验。

2结果2.1采用Lieber-DeCarli酒精液体模型饲料建立AFLD含酒精5%，wt/V的LD饲料喂养小鼠4周后，小鼠体重与对照组相比差异无统计学意义（P>0.05），50 mg/kg DIM和DIM联合酒精染毒后，小鼠体重与对照组相比也无统计学意义（P>0.05）。见图1。

2.2酒精和DIM处理小鼠后肝功能的改變酒精染毒后，小鼠肝脏的ALT和AST与对照组相比显著升高（P<0.05），DIM单独处理后，对肝功能没有显著的影响，但DIM联合酒精染毒后，与单独酒精染毒相比，DIM能够显著降低ALT和AST的含量（P<0.05），说明DIM对酒精诱导的肝脏具有保护功能。结果见图2。

2.3酒精和DIM处理小鼠后肝脏中甘油三酯的改变采用油红O对肝细胞中甘油三酯染色后发现，酒精染毒明显增加了小鼠肝脏中甘油三酯的水平（P<0.05），DIM对肝脏中甘油三酯含量影响不明显，但能够显著降低酒精诱导的甘油三酯的累积（P<0.05），通过定量检测肝细胞中甘油三酯的浓度，与油红O染色的结果吻合。结果见图3。

2.4酒精和DIM处理小鼠后，肝细胞中内质网应激通路的改变情况内质网应激在酒精诱导的细胞毒性中起重要作用，因此本研究也检测了内质网通路的关键蛋白PERP、eIF和CHOP。结果见图4。酒精处理后，小鼠肝细胞中PERP和eIF的磷酸化明显增加，CHOP蛋白的表达也显著上调。DIM单独处理对通路影响不明显，但DIM和酒精联合处理后，DIM能够显著降低PERP和eIF的磷酸化水平，CHOP的蛋白水平也出现显著的下调，说明DIM能够抑制酒精诱导的内质网应激的激活。

3讨论

酒精性脂肪肝是由于长期过量摄入乙醇导致肝细胞脂肪代谢紊乱和脂质在肝细胞中沉积，从而形成脂肪肝[1～2]。本实验结果表明，乙醇暴露后小鼠肝指数增加，肝脏甘油三酯含量积聚，血清ALT和AST的水平升高，肝细胞中出现脂质累积，周围出现轻微的炎症，说明模型构建成功。DIM作为一种具有生物活性的植物化学物，被广泛用在缓解炎症以及抗肿瘤的研究中[10～11]。研究发现，DIM也能够缓解多种毒物诱导的急慢性肝毒性[12～13]。我们动物实验研究发现DIM能够降低乙醇暴露后引起的肝损伤，包括降低血清ALT、AST的水平，减少肝细胞脂质沉积，改善了酒精性脂肪肝。内质网应激能够介导甘油三酯的进一步累积和诱导肝细胞凋亡，其在酒精性脂肪肝发生和发展过程中发挥重要作用[14]。酒精暴露后引起氧化应激和内质网应激导致肝細胞毒性和肝细胞中甘油三酯的持续累积，甘油三酯累积进一步导致线粒体功能紊乱，加重脂质累积，引起恶性循环，最终导致细胞出现凋亡[15]。本研究发现酒精诱导的肝脏脂肪变性中，内质网应激通路被激活，与之前文献报道一致。而DIM能够抑制酒精诱导的内质网通路的激活，因此可以推断DIM可能通过此通路来逆转酒精性脂肪肝。

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