沙棘黄酮对泌乳中期荷斯坦奶牛生产性能、乳中生物活性成分及血清生化和抗氧化指标的影响

2022-07-11张一涵贺李莹熊本海蒋林树

动物营养学报 2022年6期

张一涵贺李莹陈逸熊本海王慧* 蒋林树*

(1.北京农学院动物科学技术学院，奶牛营养学北京市重点实验室，北京 102206；2.中国农业科学院北京畜牧兽医研究所，北京 100193)

沙棘(HippophaerhamnoidesLinn)又名醋柳、酸刺，胡颓子科，沙棘属，具有抗寒耐暑、适应能力强的特性[1]。我国沙棘的林地面积约占世界的90%，主要分布生长在我国内蒙、甘肃、陕西等地区[2]。早在公元8世纪时，我国唐代中医名著《月王药诊》中就出现了对沙棘药食同源特性“沙棘医治培根、增强体阳、开胃舒胸、饮食爽口、易消化”的记载；1977年，沙棘被正式列入《中华人民共和国药典》[3-4]。沙棘黄酮是沙棘中的主要生物活性成分，具有抗菌、抗氧化、调节生长发育、提高饲料转化率、增强动物免疫性能等功能[5]。研究表明，沙棘黄酮可以提高肉鸡的胴体品质并改善鸡肉品质[6]。郑伟等[7]研究发现，沙棘黄酮能够提高海兰褐壳蛋鸡的免疫机能，并且能够提高其合格蛋平均产蛋率，降低残次蛋率。饲粮中添加沙棘叶黄酮能够提高阿勒斯泰羊的平均日增重、平均日采食量及饲料转化率[8]。目前已报道文献中对沙棘黄酮的研究主要集中在提取工艺、活性成分及其体外抗氧化能力评价，并且在动物上的应用多以单胃动物和羊为研究对象，在奶牛中的应用效果尚未有文献报道。因此，本研究拟探究沙棘黄酮对泌乳中期荷斯坦奶牛生产性能、乳中生物活性成分及血清免疫和抗氧化指标的影响，旨在为沙棘黄酮在奶牛上的应用提供科学理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验所用沙棘黄酮购自西安某科技有限公司，纯度为40%，其他成分为沙棘多糖(20%)、粗灰分(20%)、粗蛋白质(10%)、水分(3%)、其他(7%)。

1.2 试验设计与饲养管理

试验于2020年8月至2020年10月在北京某牛场进行。选择305 d产奶量[(35.5±3.6)kg]、泌乳日龄[(91.0±22.1)日龄]、胎次[(1.3±0.5)胎]相近的健康中国荷斯坦奶牛30头，按产奶量、胎次、泌乳期等相近原则随机分为3个组，每组10头。各组在饲喂基础饲粮的基础上以口腔投喂的方式分别添加0(对照)、60和100 g/(d·头)的沙棘黄酮(添加剂量由查阅文献及本实验室前期对其他黄酮的研究结果[9-10]综合确定)。各组的试验牛均单独采用散栏带卧床式饲养，每天07:00、13:00、18:00对奶牛进行投料，09:30、15:30、21:30进行挤奶。试验期间奶牛自由采食并保证每群试验牛槽内有5%～10%的剩料量，自由饮水，牛舍每天清扫、清粪。整个试验期共75 d，其中预试期15 d，正试期60 d。基础饲粮参照NRC(2001)奶牛饲养标准配制，以全混合日粮(TMR)形式饲喂，基础饲粮组成及营养水平见表1。

表1 基础饲粮组成及营养水平(干物质基础)

1)每千克预混料含有 One kg of premix contained the following: Cu 1 250 mg，Zn 4 900 mg，Mn 1 760 mg，I 50 mg，Se 61 mg，VA 240 000 IU，VD 338 000 IU，VE 1 000 IU。

1.3 样品采集与指标测定

1.3.1 基础饲粮营养成分测定

采用四分法收集饲粮样品，储存于-20 ℃用于分析。干物质含量采用烘箱干燥法测定，粗蛋白质含量参照GB/T 6432—2018进行测定，粗脂肪含量参照GB/T 6433—2006/ISO 6492:1999进行测定，酸性洗涤纤维和中性洗涤纤维含量参照GB/T 6434—2006进行测定，钙含量参照GB/T 6436—2018进行测定，磷含量参照GB/T 6437—2018进行测定。

1.3.2 干物质采食量(DMI)测定

试验期间，每日测定每组试验牛的饲料供给量和剩余量，计算每试验组奶牛的DMI：

DMI=(投料量-剩料量)×干物质百分比。

1.3.3 产奶量测定

通过牛场阿菲金管道式挤奶系统记录所有试验牛每天的产奶量。

1.3.4 乳样采集与指标测定

1.3.4.1 乳样采集

于正试期第1、15、30、45、60天分别采集各组奶牛早、中、晚的鲜奶样。挤奶前清洁乳房，弃去头3把奶，按照早、中、晚4∶3∶3的比例混合得到50 mL待测奶样。

1.3.4.2 乳样指标测定

乳成分测定：将早、中、晚4∶3∶3比例混合的乳样置于奶牛生产性能测定(DHI)专用样品瓶中，加入重铬酸钾作为奶样防腐剂，混合均匀后，于采集当日送至北京市清河奶牛中心对奶样中乳蛋白率、乳脂率、乳糖率及体细胞数进行测定。

4%乳脂校正奶产量、能量校正奶产量和饲料转化效率计算公式如下：

4%乳脂校正奶产量(kg/d)=0.4×产奶量+15×产奶量×乳脂率[12]；能量校正奶产量(kg/d)=产奶量×(383×乳脂量+242×乳蛋白量+783.2)/3 140[13]；饲料转化效率=4%乳脂校正奶产量/干物质采食量。

乳中生物活性成分测定：使用酶联免疫吸附测定(ELISA)试剂盒(购自江苏雨桐生物技术有限公司)测定乳中生物活性成分(溶菌酶、乳过氧化物酶、β-乳球蛋白、乳铁蛋白)含量，测定方法与步骤详见试剂盒说明书。

1.3.5 血样采集与指标测定

1.3.5.1 血样采集

在正试期第1、30、60天晨饲前，采用尾静脉采血方法采集所有试验牛血液20 mL，并将血液样本收集至真空采血管中，使用Sorvall MTX 150型台式离心机(美国赛默飞世尔科技有限公司)在4 ℃、3 000×g条件下离心15 min，分离血清于-80 ℃下保存待测。

1.3.5.2 血清生化和抗氧化指标测定

血清生化指标包括：葡萄糖(葡萄糖氧化酶法)、总蛋白(BCA法)、白蛋白(溴甲酚绿比色法)、总胆固醇(COD-PAP法)、甘油三酯(GPO-PAP法)、高密度脂蛋白(直接法)、低密度脂蛋白(直接法)。

血清抗氧化指标包括：过氧化氢酶(钼酸铵法)、谷胱甘肽过氧化物酶(二硫代二硝基苯甲酸比色法)、总抗氧化能力(比色法)、丙二醛(TBA法)及硫氧还蛋白氧化还原酶(分光光度法)。

上述指标均使用南京建成生物工程研究所试剂盒测定，测定方法与步骤详见试剂盒说明书。

1.4 数据统计与分析

试验数据用Excel 2010软件录入试验数据并进行初步整理，使用SPSS 25.0统计分析软件进行单因素方差分析，采用Duncan氏法进行多重比较，结果用平均值和均值标准误(SEM)表示，P<0.05为差异显著。

2 结果

2.1 沙棘黄酮对泌乳中期荷斯坦奶牛生产性能和乳成分的影响

由表2可知，饲粮中添加沙棘黄酮对泌乳中期荷斯坦奶牛的干物质采食量无显著影响(P>0.05)。与对照组相比，饲粮中添加60和100 g/(d·头)沙棘黄酮均显著提高了泌乳中期荷斯坦奶牛的产奶量(P<0.05)；饲粮中添加60 g/(d·头)沙棘黄酮显著提高了泌乳中期荷斯坦奶牛的乳蛋白率、乳脂率、4%乳脂校正奶产量和能量校正奶产量；饲粮中添加100 g/(d·头)沙棘黄酮对泌乳中期荷斯坦奶牛的乳成分均无显著影响(P>0.05)。

表2 沙棘黄酮对泌乳中期荷斯坦奶牛生产性能和乳成分的影响

2.2 沙棘黄酮对泌乳中期荷斯坦奶牛乳中生物活性成分的影响

由表3可知，与对照组相比，饲粮中添加60和100 g/(d·头)沙棘黄酮均显著提高了泌乳中期荷斯坦奶牛乳中溶菌酶、乳铁蛋白、β-乳球蛋白和乳过氧化物酶含量(P<0.05)。其中，添加100 g/(d·头)沙棘黄酮组泌乳中期荷斯坦奶牛乳中溶菌酶、乳铁蛋白、β-乳球蛋白和乳过氧化物酶含量显著高于添加60 g/(d·头)沙棘黄酮组(P<0.05)。

表3 沙棘黄酮对泌乳中期荷斯坦奶牛乳中生物活性成分的影响

2.3 沙棘黄酮对泌乳中期荷斯坦奶牛血清生化指标的影响

由表4可知，与对照组相比，饲粮中添加60 g/(d·头)沙棘黄酮显著提高了泌乳中期荷斯坦奶牛的血清总蛋白和胆固醇含量(P<0.05)，对血清白蛋白、葡萄糖、甘油三酯、高密度脂蛋白、低密度脂蛋白含量无显著影响(P>0.05)；饲粮中添加100 g/(d·头)沙棘黄酮对泌乳中期荷斯坦奶牛的血清生化指标均无显著影响(P>0.05)。

表4 沙棘黄酮对泌乳中期荷斯坦奶牛血清生化指标的影响

2.4 沙棘黄酮对泌乳中期荷斯坦奶牛血清抗氧化指标的影响

由表5可知，与对照组相比，饲粮中添加60和100 g/(d·头)沙棘黄酮降低了泌乳中期荷斯坦奶牛的血清丙二醛含量，但差异不显著(P>0.05)；饲粮中添加60 g/(d·头)沙棘黄酮显著提高了泌乳中期荷斯坦奶牛的血清谷胱甘肽过氧化物酶、硫氧还蛋白氧化还原酶活性(P<0.05)；饲粮中添加100 g/(d·头)沙棘黄酮对泌乳中期荷斯坦奶牛的血清抗氧化指标均无显著影响(P>0.05)。

表5 沙棘黄酮对泌乳中期荷斯坦奶牛血清抗氧化指标的影响

3 讨论

3.1 沙棘黄酮对泌乳中期荷斯坦奶牛生产性能和乳成分的影响

黄酮类化合物是植物代谢时转化生成的天然活性成分[14]。大量研究表明，在奶牛饲粮中添加适量黄酮类化合物有助于提高奶牛采食量和产奶量[15]。Zhan等[16]在奶牛饲粮中添加60 g/d苜蓿黄酮显著提高了泌乳期奶牛的采食量和产奶量。Lundh[17]研究发现，在奶牛饲粮中添加大豆异黄酮有利于提高产奶量，进一步试验证实大豆异黄酮甚至可提高日均产奶量。本研究中，饲粮中添加60和100 g/(d·头)沙棘黄酮也可以显著提高泌乳中期荷斯坦奶牛产奶量，与前人研究结果一致。黄酮类化合物影响产奶量的原因可能有以下2点：其一，黄酮类化合物能够调控机体甲状腺素的分泌水平，促进蛋白质合成，加快机体新陈代谢的速率，进而提高生产性能[18]；其二，黄酮类化合物通过调控与催乳素受体转导相关的信号通路，影响奶牛乳腺上皮细胞的产奶性能，进而促进乳汁的分泌[19]。饲料转化效率是评价泌乳奶牛将饲料转化为牛奶的有力工具，其以干物质采食量反映奶牛的饲料成本，以标准奶量直接反映奶牛养殖的收益回报，是衡量奶牛养殖场效益的重要指标，具有现实的理论和实践指导意义。王典等[20]研究发现，在奶牛饲粮中添加大豆磷脂、长链脂肪酸和复合酶制剂组合能够提高饲料转化效率，而添加烟酸和纤维素复合酶组合则对饲料转化效率无显著影响。本研究中，饲粮中添加60 g/(d·头)沙棘黄酮显著提高了泌乳中期荷斯坦奶牛的产奶量和4%乳脂校正奶产量，但对饲料转化效率无显著影响。饲料转化效率与奶牛品种、饲养管理、奶牛配方等多种因素有关外，除此之外，提高奶牛饲料转化效率的根本在于通过提高瘤胃内微生物对有营养物质的利用效率提高奶牛的饲料转化效率[20-21]。本研究中，饲粮中添加沙棘黄酮对饲料转化效率不显著的原因可能在于其对瘤胃中营养物质的转化与利用不足有关。因此，从经济效益考虑，在提高奶牛产奶量的同时还要综合提高奶牛的饲料转化效率。

乳成分是体现泌乳奶牛生产性能的重要指标[22]。Zhan等[16]选用初产奶牛探究苜蓿黄酮对乳成分的影响，结果表明，饲粮中添加不同剂量(0、20、60和100 mg/kg)的苜蓿黄酮对初产奶牛的乳脂、乳蛋白及乳糖含量均无显著影响，而乳中总固形物含量则随苜蓿黄酮添加剂量的增加而呈线性降低。本研究中，饲粮中添加60 g/(d·头)沙棘黄酮显著提高了泌乳中期荷斯坦奶牛的乳脂率、乳蛋白率，而饲粮中添加100 g/(d·头)的沙棘黄酮对乳成分含量均无显著影响，证明在提高泌乳奶牛产奶量及乳成分含量方面，60 g/(d·头)沙棘黄酮的饲喂效果要优于100 g/(d·头)。本研究所得到的结果与文献中报道不一致，一方面可能是由于不同来源的黄酮类化合物组成和结构的差异会对其功能造成较大影响，另一方面可能是不同黄酮类化合物在不同泌乳时期代谢途径和方式会有差异，从而对乳成分造成影响。

3.2 沙棘黄酮对泌乳中期荷斯坦奶牛乳中生物活性成分的影响

牛奶中的生物活性成分(如免疫球蛋白、乳铁蛋白等)能够提高机体免疫力[23-24]。这些生物活性成分在调节人体新陈代谢、保护健康等方面具有积极作用。因此，天然存在于牛奶中的生物活性成分及其衍生物不断得到认可和广泛应用。β-乳球蛋白是一种既能够改善产品风味，又能够提高机体免疫力的蛋白质，主要通过结合或降解体内的脂肪酸、维生素发挥作用[25]。乳铁蛋白是一种含量高、来源广、功能多的铁结合糖蛋白，由于它特有的能与铁结合的特性，可以与细菌等有害物质竞争铁元素，从而抑制细菌生长，发挥抗菌、抗炎、免疫调节等多种生物学功能[26-27]。乳过氧化物酶、溶菌酶也属于乳中生物活性成分，前者主要通过乳过氧化物酶系统发挥抗菌活性；后者主要通过溶解革兰氏阳性菌增强机体免疫力，促进组织修复[28]。本试验结果表明，饲粮中添加沙棘黄酮能够极显著提高泌乳中期荷斯坦奶牛乳中乳铁蛋白、β-乳球蛋白、乳过氧化物酶以及溶菌酶含量，增强奶牛机体免疫力。

3.3 沙棘黄酮对泌乳中期荷斯坦奶牛血清生化指标的影响

血清生化指标伴随着机体代谢和健康的异常会发生相应的变化，可以反映奶牛营养水平、代谢水平、机体健康、生长发育情况和生产性能高低。血清总蛋白、总胆固醇和葡萄糖等指标则常作为反刍动物营养的指标。血清总蛋白含量可以反映机体蛋白质的吸收与合成状况，且可以促进动物生长，随着总蛋白含量升高，奶牛的代谢水平及免疫能力会相应升高[29-30]。血清白蛋白具有稳定血液渗透压、运输代谢物质的作用[31]。在本试验中，饲粮中添加100 g/(d·头)沙棘黄酮对血清总蛋白和白蛋白含量均无显著影响；饲粮中添加60 g/(d·头)沙棘黄酮提高显著了血清总蛋白含量，血清白蛋白呈现上升趋势。赵萌等[32]报道，藤茶总黄酮可以提高仔猪血清总蛋白和白蛋白含量，进而使仔猪蛋白质代谢加强，生长速度加快，与本试验结果相似。这说明沙棘黄酮可以为血清中蛋白质合成提供更多能量，从而提高奶牛的生长性能、代谢水平和免疫能力。血清中的脂类物质主要包括甘油三酯和胆固醇，其含量能够反映体内脂肪的吸收、代谢及转运情况[33]。本试验中，饲粮中添加60 g/(d·头)沙棘黄酮显著提高了血清胆固醇含量，加快奶牛对体内脂肪的吸收并提升乳脂率，为合成乳脂提供了更丰富的前体物质。刘艳丰等[34]探究沙棘叶黄酮对阿勒泰羊血清生化指标的影响，表明沙棘叶黄酮可以提高阿勒泰羊的生长率和饲料转化率，促进血清中蛋白质的合成，并显著增加了血清胆固醇含量，与本研究中血清总蛋白和胆固醇含量上升的结果一致。血清葡萄糖含量可以反映机体能量平衡及营养状况，正常状态下，动物血液中的葡萄糖含量应保持恒定，对于奶牛而言，其血清葡萄糖含量应该保持在2.78～4.10 mmol/L[35-36]。本试验中，各组血清葡萄糖含量没有显著差异，均在正常范围区间，这表明沙棘黄酮对泌乳奶牛的能量平衡无不良影响，可以在一定程度上提升奶牛的适应与抗逆能力[37]。

3.4 沙棘黄酮对泌乳中期荷斯坦奶牛血清抗氧化指标的影响

活性氧(ROS)的过量积累导致机体氧化-抗氧化系统失衡，诱发氧化应激反应，进而导致一系列疾病的发生。抗氧化防御系统是由体内的抗氧化剂形成的一道保护屏障，保护机体免受氧化损伤[38]。当机体遭受外界应激时会激活抗氧化防御系统，该防御系统在机体内共有2道防线，第1道防线由多种抗氧化酶组成，包括谷胱甘肽过氧化物酶、过氧化氢酶等[39-40]；第2道防线由非酶类物质构成，主要包括维生素C、维生素E等[41]。谷胱甘肽过氧化物酶是一种重要的过氧化物分解酶，它可以催化有毒的过氧化物还原成无毒的羟基化合物，进而保护细胞膜的结构和功能不受损害[42]。硫氧还蛋白氧化还原酶在硫氧还蛋白系统中发挥着重要功能，包括抗氧化、抑制炎症、减少细胞凋亡等，也是唯一能够还原硫氧还蛋白的蛋白酶，对于奶牛而言，硫氧还蛋白氧化还原酶表现出的活性与氧化应激时刻保持着动态平衡，是反映奶牛机体正常的重要因素[43]。丙二醛是生物膜遭受氧自由基攻击形成的产物，其含量间接反映机体细胞受自由基攻击的严重程度，也间接反映了机体抗氧化能力的高低[44-45]。本试验中，饲粮中添加60 g/(d·头)沙棘黄酮显著提高了奶牛血清谷胱甘肽过氧化物酶和硫氧还蛋白氧化还原酶活性，血清丙二醛含量也有下降趋势，缓解了奶牛热应激并提高了抗氧化能力。Kong等[46]用黄酮类化合物作为饲料添加剂饲喂犊牛，发现机体抗氧化能力显著增强。竹叶提取物对热应激奶牛抗氧化性能的影响试验证明了竹叶提取物可以极显著提高血清谷胱甘肽过氧化物酶活性，增强奶牛的抗氧化能力，缓解奶牛热应激[9]。结合本试验结果分析，饲粮中添加60 g/(d·头)的沙棘黄酮显著提高了泌乳中期荷斯坦奶牛血清谷胱甘肽过氧化物酶、硫氧还蛋白氧化还原酶活性，而饲粮中添加100 g/(d·头)沙棘黄酮对血清抗氧化指标均无显著影响，整体而言，饲粮中添加60和100 g/(d·头)沙棘黄酮有降低血清丙二醛含量的趋势，表明沙棘黄酮能够通过调节泌乳中期荷斯坦奶牛抗氧化酶活性，提高抗氧化能力。