徐 宁，冷俊杰，姚卓亚，唐 碧，康品方，张 恒

（蚌埠医学院第一附属医院心血管科，安徽 蚌埠 233000）

心房颤动（atrial fibrillation，AF）是最常见的心律 失 常，据 统 计，全 世 界AF 患 者3 000 多 万 人［1⁃3］。尽管针对AF 的治疗取得了进步，但其仍是中风、心力衰竭和猝死的主要原因之一［4⁃6］。目前对AF 病理生理学的认识已取得实质性进展，但AF 的病因和致病因素，包括其潜在的机制还不完全清楚。因此，需要生物标志物为AF 的诊断及治疗提供新的实验依据。

目前认为自主神经重构、心房电重构和心房结构重构是AF 的主要机制［7］。既往研究证实，AF 的发病率及预后均与血清中炎症生物标志物的水平有 关［8，9］。肿 瘤 坏 死 因 子⁃α（TNF⁃α）、核 因 子⁃κB（NF⁃κB）是最具特征性的炎症信号转导途径。有研究显示［10］可通过抑制NF⁃κB/TNF⁃α 信号通路改善AF 的易感性。

TNF⁃α 是一种内源性炎症介质，参与多种细胞过程，包括激活参与炎症和免疫调节反应的基因、增殖、生长抑制和细胞死亡［11，12］。NF⁃κB 是氧化还原敏感型转录因子，在氧化应激时可抑制心肌Na+通道的转录，参与AF 发生的离子通道和转录因子的调节［13］。

由于TNF⁃α、NF⁃κB 在AF 动物试验中研究甚多，但在临床上研究较少，同时AF 的死亡率及发病率仍逐步上升，所以生物标记物诊断及治疗AF 仍需进一步开发新的思路。本研究旨在探讨炎症经典信号通路主要参与者NF⁃κB、TNF⁃α 水平与AF患者病情的关系，为临床对AF 的诊断和病情的严重程度评估及可能的治疗提供一些新的思路。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选 择2020 年1 月～2021 年12 月 因AF 在 我 院 住院的患者135 例纳入研究。所有AF 患者根据2014年美国心脏协会（AHA）/美国心脏病学会（ACC）/美国心脏节律学会（HRS）AF 指南［14］诊断，并 经 心电图（ECG）或动态心电图（Holter）监测证实。纳入标准：临床资料完整以及根据AF 的发生及持续时间分为阵发性房颤（PAF）和非阵发性房颤（nPAF）。诊断标准：PAF 定义为AF 持续少于7 d，并自行或经干预治愈。排除标准：合并有肥厚型心肌病、重症感染、起搏器植入患者、心电复律的患者、其他类型心律失常患者、各类恶性肿瘤、慢性肾病、急性ST 段抬高型心肌梗死、肺栓塞的患者。将135 例AF 患者分为PAF 和nPAF，其 中PAF 75 例，nPAF 60 例。同时选择无AF 病史的体检者107 例作为正常对照组。 本研究经本院伦理委员会的批准（2019KY023），被研究对象均签署知情同意书。

1.2 标本采集及准备

所有被研究对象禁食水8 h 后抽取外周静脉血5 mL 于肝素抗凝试管中，3 000 r/min 离心10 min后吸取上清，并于−80 ℃冰箱中保存备用。抽取血清后加入与血清同等剂量的PBS 抽吸混匀下层组织，将混匀的下层组织加入同等剂量的淋巴细胞分离液中（此过程需要贴壁、缓慢加入，使得混匀的下层组织悬于淋巴细胞分离液上），2 000 r/min 离心20 min，分离后得到四层，从上到下，依次为血浆、淋巴细胞、淋巴细胞分离液、红细胞；吸取中间的淋巴细胞层加入15 mL 离心管中，用生理盐水配平至10 mL，4 000 r/min 离心5 min，移除上层生理盐水，加入淋巴细胞冻存液，抽吸混匀后移至冻存管中，并于−80 ℃冰箱中保存备用。

1.3 血清TNF⁃α、NF⁃κB 活性检测

将标本融化后使用HumanTNF⁃α、NF⁃κB（上海羽朵）检测血清TNF⁃α、NF⁃κB 水平，采用酶联免疫吸附法（ELISA 法），按照试剂盒说明书进行操作后 得 到TNF⁃α、NF⁃κB 的OD 值，代 入 标 准 品 与OD 值之间的回归曲线方程，计算浓度值。

1.4 Western Blot 检测NF⁃κB 在AF 患者及正常对照组外周血淋巴细胞中的表达情况

采用BCA 方法测得AF 患者及正常对照组外周血中蛋白浓度，10%SDS⁃PAGE 电泳（80 V 120 min）；PVDF 膜转膜（200 mA 100 min）；脱脂牛奶常温封闭2 h；一抗（1∶1 000）室温孵育0.5 h；4 ℃冰箱过夜；二抗（羊抗兔1∶8 000）室温孵育1 h；ECL 发光试剂盒发光，凝胶成像系统获取图像。

1.5 统计学处理

2 结果

2.1 两组基线资料比较

两组研究对象的年龄有显著性差异（P<0.05），提示年龄与AF 有关；两组研究对象性别、高血压病史、糖尿病史、血常规、肝肾功能等相关指标比较，差异无统计学意义（P>0.05）。见表1。

表1 两组基线资料比较Tab 1 Comparison of baseline data between the two groups of subjects

2.2 两组TNF⁃α、NF⁃κB 与心脏超声中心功能相关指标的比较

与正常对照组相比，AF 组TNF⁃α、NF⁃κB 水平与LVEDD、LVEDV 均升高，LVEF、FS 下降，差异有统计学意义（P<0.05）。见表2。

海岛是一个特殊的地域单元，在海洋经济大发展的背景下，海岛不仅是维护国家海洋权益的战略要地，也是海陆统筹发展的重要基地、海洋经济发展的前沿阵地、以及区域可持续发展的战略资源宝库[1]。

表2 两组TNF⁃α、NF⁃κB 与LVEF、LVEDD、LVEDV、FS 比较（±s）Tab 2 Comparison of TNF⁃α and NF⁃κB with LVEF，LVEDD，LVEDV and FS in the two groups（±s）

表2 两组TNF⁃α、NF⁃κB 与LVEF、LVEDD、LVEDV、FS 比较（±s）Tab 2 Comparison of TNF⁃α and NF⁃κB with LVEF，LVEDD，LVEDV and FS in the two groups（±s）

指标t P TNF⁃α(pg/mL)NF⁃κB(pg/mL)LVEF(%)LVEDD(mm)LVEDV(mL)FS(%)正常对照组（n=107）19.12±9.24 224.34±89.74 58.24±7.02 46.53±4.93 32.84±6.17 31.93±5.29 AF 组（n=135）26.33±7.54 258.92±61.96 54.64±10.14 50.38±6.78 37.81±7.92 29.90±7.11 6.530 3.395−3.261 5.107 5.494−2.548 0.000 0.001 0.001 0.000 0.000 0.011

2.3 不同AF 类型患者TNF⁃α、NF⁃κB 与心脏超声中心功能相关指标的比较

与PAF 组 比 较，nPAF 组TNF⁃α、NF⁃κB 浓 度与LVEDD、LVEDV 均升高，LVEF、FS 下降，差异有统计学意义（P<0.05）。见表3。

表3 不同AF 类型患者TNF⁃α、NF⁃κB 与LVEF、LVEDD、LVEDV、FS 比较（±s）Tab 3 Comparison of TNF⁃α and NF⁃κB with LVEF，LVEDD，LVEDV and FS in patients with different atrial fibril⁃lation types（±s）

表3 不同AF 类型患者TNF⁃α、NF⁃κB 与LVEF、LVEDD、LVEDV、FS 比较（±s）Tab 3 Comparison of TNF⁃α and NF⁃κB with LVEF，LVEDD，LVEDV and FS in patients with different atrial fibril⁃lation types（±s）

指标t P TNF⁃α(pg/mL)PAF 组（n=75）24.40±8.61 nPAF 组（n=60）28.75±5.06−3.666 0.000 NF⁃κB(pg/mL)247.49±58.05 273.20±64.19−2.412 0.017 LVEF(%)LVEDD(mm)LVEDV(mL)57.64±10.31 48.85±4.90 34.84±5.22 50.88±8.64 52.28±8.22 41.53±9.10 4.062−2.853−5.069 0.000 0.005 0.000 FS(%)32.67±6.88 26.45±5.79 5.699 0.000

2.4 TNF⁃α、NF⁃κB 与心脏超声中心功能相关指标的相关性分析

通 过Pearson 相 关 性 分 析：AF 组TNF⁃α、NF⁃κB 与LVEDD、LVEDV 高于正常组呈正相关（r=0.163、0.182、0.167、0.144，P<0.05），与LVEF、FS 呈负相关（r=−0.733、−0.716、−0.312、−0.314，P<0.01）。见表4。

表4 TNF⁃α、NF⁃κB 与LVEF、LVEDD、LVEDV、FS 的相关性分析Tab 4 Correlation analysis of TNF⁃α，NF⁃κB with LVEF，LVEDD，LVEDV and FS

2.5 两组外周血淋巴细胞中NF⁃κB 蛋白表达水平比较

PAF 组NF⁃κB 蛋 白 表 达 高 于CON 组，低 于nPAF 组，差异有统计学意义（P<0.05）。见图1。

图1 两组外周血淋巴细胞中NF⁃κB 蛋白表达水平比较Fig 1 Comparison of NF‑κB protein expression levels in peripheral blood lymphocytes between two groups

3 讨论

AF 是一种多因素参与的复杂疾病。AF 的存在增加了心血管疾病患者的死亡率，降低了其生存质量［15］。目前研究表明，结构重构和电重构是AF持续存在的两个主要机制，而结构重构中的心房纤维化与炎症反应密切相关［16］。既往也有研究发现在AF 患者的心房组织中观察到了炎性细胞浸润，发现炎症反应伴随AF 的发生发展过程［16⁃18］。因此，AF 的发生、发展涉及心房纤维化、炎症反应等多种机制。

多项研究表明［19⁃21］，AF 发病率的增加与转录因子蛋白家族成员NF⁃κB 的激活有关。Ye 等［10］研究提 示 松 鼠 素（5，7⁃二 羟 基 黄 酮）可 抑 制NF⁃κB/TNF⁃α 信号通路，降低促炎细胞因子水平，这可能有助于改善AF 的易感性。也有研究发现秋水仙碱可通过抑制炎症反应介导的心房纤维化而降低大鼠AF 的易感性［22］。本研究设想NF⁃κB/TNF⁃α 信号通路表达的下调、炎症反应的减轻，也可在一定程度上改善AF 患者的心房纤维化。因此，研究NF⁃κB、TNF⁃α 在AF 患者中的表达，可为AF 的诊断和治疗提供一种新的思路。

TNF⁃α 是哺乳动物在健康和疾病条件下免疫反应的关键介质和调节因子，调控免疫系统的发育、细胞生存信号通路、细胞增殖和调节代谢过程［6］。TNF⁃α 与AF 的发生和维持密切相关，主要表现在以下两个方面［29］：（1）TNF⁃α 可促进心房纤维化和心房扩张，改变连接蛋白Cx43 的表达，导致异质传导；（2）TNF⁃α 还可直接改变心肌细胞内钙离子的处理，为AF 的发生提供底物。由此可见，TNF⁃α 可以触发AF，而且可以为AF 导致心功能恶化提供理论支持。本研究显示AF 组血清中TNF⁃α水平高于正常对照组，说明TNF⁃α 血清浓度的增加与AF 的发生相关；通过测定PAF 与nPAF 中TNF⁃α 的血清浓度，发现TNF⁃α 在两种AF 类型中的表达不同，且随着AF 患者病情严重程度的增加而逐渐升高，具有统计学意义。这说明血清中TNF⁃α 浓度的升高与AF 的发生、发展相关。

此外，本研究通过对研究对象的心脏彩超指标进行分析发现：AF 患者LVEDD、LVEDV 等心脏纤维化的量化指标高于对照组，且随着AF 病情的严重而增加。本研究进一步探讨NF⁃κB/TNF⁃α 信号通路相关因子的表达与心脏纤维化的量化指标及血流动力学之间的关系，发现AF 患者血清中TNF⁃α、NF⁃κB 水 平 与LVEDD、LVEDV 呈 正 相关，与LVEF、FS 呈负相关。据此，我们推测机体通过激活NF⁃κB/TNF⁃α 通路，引起过度的炎症反应进而加重心室重构，使得LVEDD、LVEDV 等指标增加，而患者心脏重构的加剧进而引起了心功能的恶化，使得LVEF、FS 等指标下降。

综上所述，本实验发现TNF⁃α、NF⁃κB 水平在AF 患者中升高，而且随着患者AF 病情严重程度的升高而逐渐增高。在以后的临床工作中一方面可针对性的检测TNF⁃α、NF⁃κB 水平，对AF 的早期诊断及严重程度作出评估，可显著减少卒中、心衰等并发症的发生，对患者的预后产生积极影响；另一方面，也可通过抑制NF⁃κB/TNF⁃α 信号通路相关因子的表达，为AF 患者的新药研发及个体化治疗提供新的理论基础。

作者贡献度说明：

徐宁：进行实验，整理数据，撰写论文；张恒、康品方、唐碧：对实验进行设计以及论文内容做出关键矫正；姚卓亚、冷俊杰：参与实验内容及收集数据。