周 珏，李云虹

（1.常熟市检验检测中心，常熟市产品质量监督检验所，江苏常熟 215500；2.苏州大学，苏州医学院公共卫生学院， 江苏苏州 215123）

食用油是生活中最常见的油脂，可为人体提供所需的能量和必需脂肪酸，能增强脂溶性维生素（A、D、E、K）的吸收和转运[1]。当食用油存储时间过久时，会发生酸败，导致无法食用。一般情况下，酸败是油脂内的脂肪酶催化所致的。食用油脂中，日常消费量最大的是植物油。植物类油脂的性质不稳定，主要与这类油脂中各类不饱和脂肪酸所含双键有关。此外，植物油在受热、光照等条件下会发生氧化反应，从而导致油脂的口感下降，同时营养价值也明显 降低[2]。

为了防止氧化酸败，通常会在食用植物油中加入叔丁基羟基茴香醚（Butylated Hydroxyanisole，BHA）、2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚（2,6-Di-tertbutyl-4-methylphenol，BHT）和 特 丁 基 对 苯 二 酚（Tertiary Butylhydroquinone，TBHQ）等抗氧化剂。抗氧化剂比油脂更容易氧化，结合容器中的氧而保护了油脂，其能与过氧化自由基结合生成稳定的化合物，阻止连锁反应的传播，延长诱导期[3]。

人工合成抗氧化剂的过量使用会对人体产生不利影响，如TBHQ对动物可能有致突变的作用，BHA和BHT有潜在致癌作用[4-8]。因此，《食品安全国家标准 食品添加剂使用标准》（GB 2760—2014）对这3类抗氧剂均有限量要求。这3类抗氧化剂常用的检测方法有比色法[9]、电分析法[10-11]、薄层色谱法[12]、化学发光法[13]、气相色谱法[14-18]、气相色谱-质谱法[19-22]、液相色谱法[23-26]和液相色谱-质谱法[27-28]。比色法虽然操作简单，但精确度不高，达不到日常检测精确度要求；电分析法分析多个合成抗氧化剂时存在伏安图重叠峰，限制了其检测范围[29-30]；薄层色谱法大多稳定性差，准确度低；气相色谱-质谱法和液相色谱-质谱法前处理烦琐且使用仪器昂贵，成本过高。气相色谱法和液相色谱法成为定量检测食用油中BHA、BHT和TBHQ最常用的分析方法。《食品安全国家标准 食品中9种抗氧化剂的测定》（GB 5009.32—2016）中的气相色谱法（第四法）前处理用凝胶渗透色谱净化，该处理法试剂损耗大，时间长，净化效果一般，而且样品回收率不高。本文探究当样品批数较多时，用溶剂进行快速提取的气相色谱方法，探究提取过程中的关键影响因素和不同植物油的提取回收率。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

BHA（固体标准品纯度为99.6%，北京坛墨质检科技有限公司）；BHT（固体标准品纯度为100%，北京坛墨质检科技有限公司）；TBHQ（固体标准品纯度为98.0%，北京坛墨质检科技有限公司）；乙腈（色谱纯，上海安谱实验科技股份有限公司）；环己烷（色谱纯，上海安谱实验科技股份有限公司）；乙酸乙酯（色谱纯，上海安谱实验科技股份有限公司）；食用油样品：均采集于超市。

1.2 仪器与设备

Agilent 7890气相色谱仪[≤0.5 ng/s（FID），安捷伦科技有限公司（美国）]；涡旋混合器（德国Heidolph公司）；氮吹仪（上海安谱实验科技股份有限公司）；TGL-16M冷冻离心机（上海卢湘仪离心机仪器有限公司）。

1.3 实验方法

1.3.1 色谱条件

气相色谱柱：毛细管柱HP-5（30 m×320 µm× 0.25 µm）；柱温：起始温度80 ℃，保持1 min，然后以10 ℃/min升温至250 ℃，保持2 min；载气：氮气，纯度≥99.999%；流速1 mL/min；进样口温度：230 ℃；进样量：1 µL；进样方式：不分流进样；检测器：FID；检测器温度：250 ℃；空气流速：300 mL/min；氢气流速：30 mL/min；氮气流速： 25 mL/min。

1.3.2 BHA、BHT、TBHQ混合标准溶液的配制

准确称取BHA、BHT、TBHQ各50 mg（精确至 0.1 mg），用环己烷-乙酸乙酯（V∶V，1∶1）溶剂定容至50 mL，配制成1 mg/mL的储备液，吸取标准储备液0.05 mL、0.10 mL、0.20 mL、0.50 mL及1.00 mL于一组10 mL容量瓶中，用环己烷-乙酸乙酯（V∶V，1∶1）溶剂定容，此标准系列的浓度为 5 µg/mL、10 µg/mL、20 µg/mL、50 µg/mL及 100 µg/mL。

1.3.3 不同提取溶剂实验

称取均匀阴性玉米油样品0.5000 g于50 mL离心管内，添加1 mg/mL的混合标准溶液0.2 mL，分别加入10.0 mL乙醇、10.0 mL甲醇、10.0 mL乙腈后放入漩涡混匀器中，以1500 r/min转速混匀 2 min。然后放入冷冻离心机以4 ℃，6000 r/min转速离心6 min。取上清液5 mL于10 mL离心管中，以50 ℃水浴加热并氮吹至近干，用环己烷∶乙酸乙酯（V∶V，1∶1）溶剂定容至2 mL，样品过滤纸（去除溶剂中剩余油脂）后进气相色谱仪分析，每组实验做两组平行。

1.3.4 不同提取转速实验

称取均匀阴性玉米油样品0.5000 g于50 mL离心管内，添加1 mg/mL的混合标准溶液0.2 mL，加入10.0 mL乙腈后放入漩涡混匀器中，分别以 500 r/min、1000 r/min、1500 r/min和2000 r/min转速混匀2 min。然后放入冷冻离心机以4 ℃、6000 r/min转速离心6 min。取上清液5 mL于10 mL离心管中，以50 ℃水浴加热并氮吹至近干，用环己烷∶乙酸乙酯（V∶V，1∶1）溶剂定容至2 mL，样品过滤纸后进气相色谱仪分析，每组实验做两组平行。

1.3.5 不同提取时长实验

称取均匀阴性玉米油样品0.5000 g于50 mL离心管内，添加1 mg/mL的混合标准溶液0.2 mL，加入10.0 mL乙腈后放入漩涡混匀器中，以1500 r/min 转 速 分 别 混 匀1 min、2 min、5 min、10 min和 20 min。然后放入冷冻离心机以4 ℃、6000 r/min转速离心6 min。取上清液5 mL于10 mL离心管中，以50 ℃水浴加热并氮吹至近干，用环己烷∶乙酸乙酯（V∶V，1∶1）溶剂定容至2 mL，样品过滤纸后进气相色谱仪分析，每组实验做两组平行。

1.3.6 不同食用油的回收率和精密度实验

分别称取玉米油、花生油、菜籽油和大豆油4种阴性样品各0.5000 g，每种油类分别添加混合标准溶液（1 mg/mL）0.04 mL、0.10 mL、0.30 mL后，各加入9.96 mL、9.90 mL、9.70 mL乙腈并放入漩涡混匀器中，以1500 r/min转速混匀5 min。然后放入冷冻离心机以4 ℃、6000 r/min转速离心6 min。取上清液5 mL于10 mL离心管中，以50 ℃水浴加热并氮吹至近干，用环己烷∶乙酸乙酯（V∶V，1∶1）溶剂定容至2 mL，样品过滤纸后进气相色谱仪分析，每组实验测定6次。

2 结果与分析

2.1 线性方程和检出限

按照实验方法1.3.1和1.3.2对混合工作溶液进行测定，色谱图见图1。以BHA、BHT、TBHQ的质量浓度为横坐标，以峰面积为纵坐标绘制工作曲线。结果表明，BHA、BHT、TBHQ的质量浓度均在5～100 µg/mL与峰面积之间呈线性关系，并以3倍信噪比（S/N）计算方法检出限，其测定的线性回归方程、相关系数见表1。

图1 3种抗氧化剂混合标准溶液的色谱图

从表1中可知，BHA、BHT、TBHQ在质量浓度为5～100 µg/mL，其相关系数R2达到0.9997以上，说明其质量浓度和色谱峰面积呈较好的线性关系，且该浓度基本可覆盖常规样品检测。检出限为1.8～4.8 mg/kg，均低于国家标准GB 5009.32—2016（第四法，气相色谱法）中检出限要求。

表1 线性参数和检出限

2.2 提取溶剂的选择

按照实验1.3.3用不同溶剂对油脂样品中的BHA、BHT和TBHQ进行提取，其回收率差异见图2。由图2可知，当乙醇为提取溶剂时，3种抗氧化剂的回收率收率低于80%，特别是BHT的回收率更是低于70%；当甲醇为提取溶剂时，BHA和TBHQ的回收率都在90%以上，但BHT的回收率低于80%；当乙腈为提取溶剂时BHA、TBHQ的回收率都在93%以上，BHT的回收率到达80%，并且此时平行实验的标准偏差在2.0%以内。综上所述，选取乙腈为提取溶剂。

图2 不同提取溶剂对BHA、BHT和TBHQ的回收率影响

2.3 提取转速的选择

按照实验1.3.4考察了不同提取转速对玉米油中BHA、BHT和TBHQ的提取效率的影响，其回收率差异见图3。由图3可知，当提取转速在 500 r/min时，3种抗氧化剂的回收率都不高；当转速 从500 r/min提 高 到1500 r/min时，BHA、BHT及TBHQ的回收率显著上升，TBHQ的回收率达到95%以上；当转速达到2000 r/min时，与转速1500 r/min相比，3种抗氧化剂的回收率没有显著提高，而是达到相对稳定状态，该平行实验的标准偏差在2.5%以内。根据实验结果选取提取转速为 1500 r/min。

图3 不同提取转速对BHA、BHT和TBHQ的回收率影响

2.4 提取时间的选择

实验1.3.5考察了不同提取时长对玉米油样品中BHA、BHT和TBHQ的提取效率的影响，其回收率差异见图4。由图4可知，随着提取时长由1 min增加到5 min，3种抗氧化剂的回收率也在不断提高，当提取时长为5 min时，BHA和TBHQ的回收率都达到95%以上，BHT也达到85%以上。此后，随着提取时长的增加，3种抗氧化剂的回收率没有显著提高，达到相对稳定的状态，该实验的标准偏差在3%以内。因此，此实验选取的提取时长为5 min。

图4 不同提取时长对BHA、BHT和TBHQ的回收率影响

2.5 4种食用油的回收率和精密度结果

按照实验1.3.6考察了用优化后的提取方法对玉米油、花生油、菜籽油和大豆油这4种常见植物油的提取效率，其回收率和精密度结果如下表2。由表2可知，4种食用油中BHA和TBHQ的加标量为 40 µg、100 µg和300 µg时，回 收 率 在95.0%～ 102.4%，不同加标量的BHT回收率也基本达到85%以上，并且3种抗氧化剂的相对标准偏差都在1.0%～2.9%。试验结果表明，本方法具有较高的精确度和较好的准确度，符合《实验室质量控制规范 食品理化检测》（GB/T 27404—2008）。

表2 回收率和精密度实验结果

3 结论与讨论

本实验通过创建和优化测定食用油中BHA、BHT、TBHQ的前处理方法，建立了一种快速、大量测定这3种抗氧化剂含量的乙腈萃取-气相色谱方法。在5～100 µg/mL范围内，3种抗氧化剂具有良好的线性关系，其相关系数R2达到0.9997以上，方法检出限范围为1.8～4.8 mg/kg。在3个不同浓度的添加水平下，平均回收率为85.0%～102.4%，相对标准偏差为1.0%～2.9%（n=6）。综上可知，此处理方法较为简单和快速，结果准确、可靠和稳定，试剂消耗较少，具有较好的灵敏度和回收率，可适用于大批量快速检测。其中BHT的回收率较BHA和TBHQ低，下一步可以尝试对提取溶剂进行优化来进一步改进该方法，以及用此方法来对其他抗氧化剂进行前处理探究[31]。