倪瑞敏，张玉洁，王秀丽，都 颖

（威海市食品药品检验检测研究院，山东威海 264209）

硝基呋喃类药物是一类广谱抗生素，可以杀灭大部分病原体，而且不容易产生耐药性[1]。硝基呋喃类药物曾在畜禽和水产品养殖行业广泛应用，用来治疗由沙门氏菌、大肠杆菌等引起的各种疾病[2]。硝基呋喃类药物原型及其代谢物均对人体有致畸、致癌等毒副作用，目前，农业农村部公告第250号规定食品动物中禁止使用硝基呋喃类[3]。硝基呋喃类原型药在生物体内代谢迅速，直接对其进行检测无法反映其真实的残留水平，但是其代谢产物易与蛋白质结合且相当稳定，故常利用代谢物的检测来反应硝基呋喃类药物的残留状况[4]。硝基呋喃代谢物的检测主要利用液相色谱-串联质谱法、高效液相色谱法、酶联免疫法等检测技术。因液相色谱-串联质谱法检测灵敏度高、结果稳定、重现性好，被应用于硝基呋喃代谢物的检测中[5]。农业部781号公告—4—2006被广泛应用于动物源性食品硝基呋喃代谢物的检测，本实验是在农业部781号公告—4—2006的基础上，分别对衍生过程、提取过程、定容过程进行优化。

1 材料与方法

1.1 仪器与设备

Qtrap 6500液相色谱质谱联用仪，美国AB SCIEX公司；恒温水浴摇床，天津市泰斯特仪器有限公司；氮吹仪，广州三研科技；涡旋振荡器，重庆赛恩斯仪器有限公司；高速冷冻离心机，凯达科学仪器有限公司。

1.2 试剂和材料

呋喃唑酮（AOZ）、呋喃西林（SEM）、呋喃妥 因（AHD）、呋 喃 它 酮（AMOZ）、AOZ-D4、AMOZ-D5、AHD-13C3和SEM-HCl-13C，15N2，标准品均为100 mg/L，购自坛墨质检科技股份有限公司；2-硝基苯甲醛，分析纯，上海麦克林生化科技有限公司；二甲亚砜（分析纯）、乙酸乙酯、磷酸氢二钾（分析纯）及盐酸（分析纯），阿拉丁。

1.3 实验方法

1.3.1 标准溶液的配制

准确移取4种硝基呋喃代谢物标准溶液，用甲醇配制成浓度为1 mg/L的混合标准储备液。使用前将混合标准储备液逐级稀释为100 μg/L和10 μg/L的混合标准工作液。内标混合标准储备液制备方法同上，使用前将内标混合标准储备液稀释为100 μg/L的混合内标标准工作液。

1.3.2 样品的前处理

称取试样2 g(精确至±0.01 g)于50 mL聚丙烯离心管中，加入10 mL 50%的甲醇水溶液，振荡 10 min，5000 r/min离心5 min，弃去液体。残留物中准确加入混合内标标准工作液50 μL，涡旋混合30 s，加入5 mL 0.5 mol/L的盐酸溶液，0.5 mL 0.05 mol/L的2-硝基苯甲醛溶液，涡旋混合1 min，置于恒温振荡器中，37 ℃避光振荡16 h。取离心净化管冷却至室温，加入5 mL磷酸氢二钾溶液，调节pH值至7.2～7.4，加乙酸乙酯10 mL，涡旋振荡 1 min，10000 r/min离心5 min，取上清液至离心管中，40 ℃氮气吹干。加5%甲醇溶液1.0 mL溶解残留物，加入2 mL正己烷去除油脂，以12000 r/min的转速离心5 min，取上清液过0.22 μm滤膜，供液相色谱-串联质谱分析。

1.3.3 标准曲线的制备

分别准确移取10 ng/mL混合标准工作溶液 0.05 mL、0.10 mL、0.20 mL、0.50 mL、1.00 mL和 2.00 mL于6个50 mL离心管中，除不加样品外，按1.3.2步骤操作。

1.4 仪器条件

1.4.1 液相色谱参考条件

色 谱 柱：C18，[150 mm×2.0 mm（id），5 μm]； 流速：0.3 mL/min；

柱温：35 ℃；进样量：5 μL；流动相A为 0.002 mol/L乙酸铵溶液；流动相B为甲醇。洗脱程序见表1。

表1 液相色谱洗脱条件

1.4.2 质谱参考条件

离子源位电喷雾离子源，扫描方式为正离子扫描，检测方式为多反应监测。相关参数见表2。

表2 多反应监测的条件

2 结果与分析

2.1 衍生过程的优化

农 业 部781号 公 告—4—2006使 用150 μL 50 mmol/L的2-硝基苯甲醛，0.5 mL 1 mol/L的盐酸，实验结果显示该方法衍生化不够充分，标准曲线的线性效果较差。主要原因可能是2-硝基苯甲醛用量过少，导致衍生效果不好，盐酸用量少，导致样品混合不均匀，并且酸性程度低，导致反应不够充分，标准曲线的线性结果不佳[6]。优化后，加入500 μL 50 mmol/L的2-硝基苯甲醛，5 mL 0.5 mol/L的盐酸，结果稳定，重复性好，回收率得到提高，且标准曲线的线性效果得到优化。

2.2 提取过程的优化

农业部781号公告—4—2006使用5 mL乙酸乙酯重复提取两次，操作烦琐，消耗时间过长，优化后，加入10 mL乙酸乙酯提取一次，不会影响回收率，可以极大节约提取时间，提高工作效率，对于实验室批量化检测具有良好的现实意义。781号公告—4—2006离心时的转速为2000 r/min，离心15 min，实验显示离心转速较低，离心效果差，上清液比较浑浊，从而影响目标物的提取效果[7]。此外，离心时间过长，还增加了检测时间。优化后，离心转速为10000 r/min，离心5 min，提高转速后，离心效果更好，分层更加明显，上清液更加澄清，同时减少离心时间有效压缩了检测时间，提高了检测效率。

2.3 定容过程的优化

农业部781号公告—4—2006定容时直接使用20%甲醇水0.5 mL溶解残余物，没有去除油脂的步骤。但是实际操作过程中动物肌肉、内脏等样品往往含有很多油脂，易造成基质效应，直接进样会影响色谱柱的寿命[8]。改进后，加入饱和的正己烷去除油脂，可以减少基质对目标物的干扰，提高检测的灵敏度，降低对色谱柱和仪器的损害。781号公告—4—2006使用的是0.45 μm的滤膜，滤膜的孔径较大，一些大分子物质可能通过滤膜进入到样品检测中，优化后，使用0.22 μm的滤膜，有利于去除更多的大分子物质，减少对目标物的干扰。

2.4 硝基呋喃代谢物的标准曲线

按照1.3.3方法制备标准曲线，在本研究的色谱和质谱条件下进行测定，结果发现AOZ、AHD、SEM及AMOZ衍生物在0.5～20.0 ng/mL线性系数良好，相关系数均大于0.99，4种硝基呋喃类代谢物的检出限均为0.25 μg/kg，定量限为0.5 μg/kg。线性方程及检出限、定量限见表3。

表3 4种硝基呋喃类代谢物的线性方程及相关系数

2.5 方法回收率和精密度

在2 g阴性猪肉样品中分别添加浓度为 10 ng/mL的4种硝基呋喃代谢物混合标准溶液 0 mL、10.00 mL、0.20 mL和1.00 mL，4种硝基呋喃代谢物的添加水平分别为0.5 μg/kg、1.0 μg/kg、5.0 μg/kg，按1.3.2进行提取和净化，每个添加水平平行测定6次，回收率和精密度见表4。AOZ、AHD、SEM及AMOZ代谢物的回收率分别为92.0%～99.2%、86.0%～96.4%、90.0%～98.4%及82.0%～93.6%，RSD为1.8%～8.8%。该方法的回收率与精密度可以满足相关规定以及批量化检测的要求。

表4 不同浓度添加水平下的回收率和精密度

3 结论

本实验对农业部781号公告—4—2006进行以下优化：①增加2-硝基苯甲醛用量，使衍生更完全； ②增加盐酸用量，样品混合更充分，衍生化更充分；③增加乙酸乙酯用量，减少提取时间，提高工作效率；④提高离心转速后分层更加明显，上清液更加澄清；⑤使用正己烷去除油脂后，可以降低基质对目标物的影响；⑥使用0.22 μm滤膜可以去除更多的大分子物质，减少对目标物的干扰。

本文建立了一种用于测定动物源性食品中硝基呋喃类代谢物多残留的液相色谱-串联质谱的分析方法。结果表明，在0.5 μg/kg、1.0 μg/kg、5.0 μg/kg 3个添加水平，AOZ、AHD、SEM及AMOZ代谢物的平均回收率为88.2%～95.4%，相对标准偏差为1.8%～8.8%，方法检出限为0.25 μg/kg，定量限为 0.5 μg/kg。各项指标均能满足动物源食品中硝基呋喃类代谢物残留量的测定要求，方法结果准确、稳定性高，为快速检测动物源性食品中硝基呋喃类代谢物残留提供了支持。