高冰心

(肇庆巨元生化有限公司，广东 肇庆 526200)

乙氧基喹啉(ethoxyquin，化学名6-乙氧基-2，2，4-三甲基-1，2-二氢喹啉，结构式见图1)是性能优良的饲料抗氧化剂之一，它能通过自身氧化作用保护其它易氧化组分，其对于改善饲料的品质，防止饲料中维生素等营养成分的氧化变质有重要的作用。一直以来，乙氧基喹啉都是饲料添加剂中广泛使用的抗氧化剂，由于2017年欧盟发布公告G/SPS/EU/190：停止在动物饲料中添加使用乙氧基喹啉。企业在更换抗氧化剂之后，还需要对其残留进行严格监控。

图1 乙氧基喹啉的结构式Fig.1 Structure of ethoxyquin

饲料添加剂一般为颗粒或粉末状，其中的乙氧基喹啉的常量检测主要采用高效液相色谱法[1]，但由于配制方法和检出限的原因，当乙氧基喹啉的残留低于20 mg/kg时，高效液相色谱法(非荧光检测器)无法检测出，需采用液相色谱-串联质谱法进行检测[2]。如今气相色谱质谱法已成为各种产品中乙氧基喹啉的微量分析的重要检测方法[3-4]，本文建立了颗粒和粉末状的饲料添加剂中乙氧基喹啉残留量的分析方法，通过对样品前处理过程的条件进行比对和优化，经气相色谱-质谱(GC-MS)检测，外标法定量分析，得到了较准确的定性定量结果。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

GCMS-QP2020气相色谱-质谱仪，日本岛津；TB-215D电子天平，北京赛多利斯公司；RE-3000旋转蒸发仪，上海亚荣有限公司。

乙氧基喹啉对照品(纯度≥98%)，江苏利田科技有限公司；水为GB/T6682规定的一级水；正己烷，甲醇，乙腈(色谱纯)，HONEYWELL公司；丙酮，环己烷，乙酸乙酯，异丙醇(色谱纯)，广州化学试剂厂；氯化钠(分析纯)，广州化学试剂厂；碳酸钠，无水硫酸钠(分析纯)，国药集团化学试剂有限公司；盐酸，氢氧化钠(分析纯)，广州化学试剂厂。

1.2 溶液制备

1.2.1 对照品溶液

精密称取乙氧基喹啉对照品30.0 mg到100 mL容量瓶中，加正己烷定容，摇匀，得0.30 mg/mL的标准储备液，此溶液避光冷藏保存。

1.2.2 样品溶液

称取1 g样品(精确至0.01 g)置于125 mL分液漏斗中，加5 mL水，再加10 mL丙酮，加氯化钠2 g，加环已烷、乙酸乙酯各5 mL，将混合液振荡提取5 min后静置分层。20 min后，用分液漏斗移取上层有机层，残渣用10 mL乙酸乙酯:环己烷=1:1的溶液提取2次，合并有机相加2 g无水硫酸钠干燥，然后将有机相提取液于旋蒸瓶中旋蒸，蒸干后，加入5 mL乙酸乙酯和5 mL环已烷溶解残渣。将上液用微孔滤膜(0.22 μm)过滤，稀释10倍后进GC-MS进行检测。

1.3 色谱条件

GC条件：色谱柱：SH-Rxi-624Sil MS毛细管柱(30 m×0.32 mm×1.8 μm)。进样口温度:280 ℃，载气：氦气，纯度≫99.999%。柱温升温程序：100 ℃保持1 min，以20 ℃/min升至200 ℃，保持6 min，以20 ℃/min升至260 ℃保持10 min。进样方式：不分流，柱流量:2.0 mL/min，进样量：1 μL。

MS条件：离子源温度：230 ℃；接口温度：250 ℃；相对电压：0.2 kV；溶剂延迟时间：2 min；检测时间：14～18 min；扫描范围：50～500；数据采集模式：选择性离子监测(SIM)，选择离子为m/z 202，174，217，145。

2 实验结果和分析

2.1 样品提取溶剂的选择

实验选取的饲料添加剂为本公司主要的三种产品：10%斑蝥黄(10% β，β-胡萝卜素-4，4-二酮)，10%阿朴酯(β-阿朴-8’胡萝卜酸乙酯)，10%β-胡萝卜素。这三种产品均为颗粒状，处理时应先加少量水溶解样品，然后再加提取溶剂提取乙氧基喹啉。

(1)本实验选取了5种不同的有机溶剂(乙腈，甲醇，正己烷，异丙醇，丙酮)，对乙氧基喹啉进行提取，其中乙腈，甲醇和异丙醇的提取过程一致，具体步骤如下：称取500 mg样品加入50 mL容量瓶中，加5 mL纯水于60 ℃超声5 min至样品全部溶解，然后加30 mL提取溶剂(乙腈、甲醇或异丙醇)于室温超声20 min，用溶剂定容，摇匀后将溶液倒于10 mL的离心管中离心5 min，取上清液移1 mL到50 mL容量瓶中，加提取溶剂(乙腈、甲醇或异丙醇)定容，取上液用微孔滤膜(0.22 μm)过滤，将这三种溶剂(乙腈、甲醇或异丙醇)提取后的溶液分别进GC-MS进检测。

(2)国家出入境检验检疫行业标准SN/T3856-2014[5]规定食品中乙氧基喹啉残留量的测定采用正己烷作为提取溶剂，测定步骤如下：

准确称取4 g(精确到0.01 g)试样于50 mL具塞离心管中，加入2 g碳酸钠和2 g无水硫酸钠，加入15 mL正己烷，均质提取3 min，于离心机中5000 r/min离心3 min，取上层正己烷层，残渣再用15 mL正己烷提取1次，合并正己烷提取液于旋蒸瓶中，旋蒸浓缩近干，用5 mL正己烷分多次洗涤残渣，转移至15 mL离心管，待净化。

在待净化液中加入0.5 mol/L的盐酸溶液5 mL，涡旋震荡1 min，静置分层，弃去上层正己烷，下层酸溶液中加入5 mol/L的氢氧化钠溶液1 mL，使溶液呈碱性(pH大于8)，加入正己烷2 mL，涡旋震荡萃取1 min，5000 r/min离心3 min，取上层正己烷，下层水层再分别用2 mL正己烷萃取2次，合并正己烷层，氮吹浓缩至干，用2 mL正己烷溶解残渣，用0.22 μm的滤膜过滤，上机测定。

本实验也采用这种方法来检测上面三种饲料添加剂中乙氧基喹啉的残留量。

(3)通过不断实验，研究建立了用丙酮作为提取溶剂检测饲料添加剂中乙氧基喹啉残留量方法(1.2.2)。以上5种溶剂对乙氧基喹啉的提取率见表1。

表1 不同溶剂对3种基质中的乙氧基喹啉的提取率 (%)Table 1 Extraction efficiency ofethoxyquin using different dissolvants in 3 feed additives

由表1可见，对这3种饲料添加剂，丙酮对乙氧基喹啉的提取效果远远大于其它4种溶剂，提取率高达94.4%。丙酮可作为最佳的提取溶剂，用于检测饲料添加剂中乙氧基喹啉的残留量。

2.2 建立标准曲线

图2 乙氧基喹啉标准(3.0 μg/mL)的色谱图Fig.2 Selected ion chromalograms of ethoxyquin standard (3.0 μg/mL)

图3 10%斑蝥黄样品的色谱图Fig.3 Selected ion chromalograms of 10% Canthaxanthin sample

取1.2.1的乙氧基喹啉标准储备溶液1 mL置于100 mL容量瓶中，摇匀，得到浓度为3.00 μg/mL的对照品溶液A。精密吸取对照品溶液A 0、0.1、0.2、1、2、5、10 mL分别置于100 mL容量瓶中，加正己烷稀释至刻度，摇匀，分别制成浓度为：0 μg/mL、0.003 μg/mL、0.006 μg/mL、0.03 μg/mL、0.06 μg/mL、0.15 μg/mL、0.30 μg/mL的标准曲线系列溶液。用GC-MS的自动进样器将上面制得的7个标准曲线系列溶液，各吸取1 μL，注入气相色谱-质谱仪测定。以峰面积为纵坐标，溶液浓度(μg/mL)为横坐标，绘制标准曲线，得到线性方程：

Y=3737748X-2733.131,r2≥0.9999

结果表明，乙氧基喹啉在0～0.30 μg/mL的范围内有良好的线性关系，进GC-MS检测的样品浓度在这个范围内能得到较准确的测量结果。

2.3 最低检出限

采用GCMS软件的QAQC功能，计算在以上三种饲料添加剂基体中的乙氧基喹啉的检出限(mg/kg)，结果为：10%斑蝥黄0.0098 mg/kg，10%阿朴酯0.0067 mg/kg，10%β-胡萝卜素0.0089 mg/kg。乙氧基喹啉的检出限在0.007～0.01 mg/kg的范围内。

2.4 精密度试验

精密度试验采取乙氧基喹啉的标准溶液和含有乙氧基喹啉的样品进行实验。吸取浓度为0.30 μg/mL的对照品溶液2 mL，装入样品瓶中，在上文条件中连续进样5次，得到乙氧基喹啉含量的RSD(n=5)为0.79%。

用上文1.2.2的方法分别处理1批10%斑蝥黄、10%阿朴酯和10%β-胡萝卜素样品(样品在最近5年的产品中随机选取)，将得到样品溶液10 mL，分别装入样品瓶中，在相同的条件下连续进样5次，测定结果如表2所示。

表2 精密度实验Table 2 Precision

由表2可知，在上面三种基质的精密度实验中，乙氧基喹啉含量的RSD(n=5)为1.04%～2.60%，表明这种方法的精密度良好。

2.5 回收率试验

分别称取1批10%斑蝥黄，10%阿朴酯，10%β-胡萝卜素样品(精确至0.01 g)各1 g，置于125 mL分液漏斗中，加5 mL水，添加乙氧基喹啉标准溶液，添加水平为0.05 mg/kg，0.10 mg/kg，0.20 mg/kg，样品按照1.2.2的方法处理好后，作为待测溶液进GC-MS测定，每个浓度平行测定8次，测定乙氧基喹啉的的含量，计算回收率，结果列于表3，结果表明此方法准确。

表3 回收率实验Table 3 Recoveries and RSD (%)

3 讨 论

通过对不同提取溶剂及配样方法的对比实验，建立了用丙酮作为提取溶剂采用GC-MS测定饲料添加剂中乙氧基喹啉含量的分析方法。该方法的检出限为0.01 mg/kg，精密度的相对标准偏差为1.04%～2.60%，加标回收率为72.96%～92.27%，相对标准偏差为2.71%～8.01%。证明该方法选择性强，重现性好，结果准确可靠。

4 结 论

现有的行业标准规定了食品中乙氧基喹啉残留的测定方法，在本文的实验中得出这种方法对固体或粉末状的饲料添加剂中的乙氧基喹啉的提取率较低，并不适合我们的日常检测。而乙腈、甲醇和异丙醇可用于液相色谱中乙氧基喹啉残留的常量分析，对于样品中微量的乙氧基喹啉提取率较低。根据本文的实验结果可知，将饲料添加剂用水溶解后，加丙酮作为提取溶剂，在环已烷和乙酸乙酯的共同作用下，乙氧基喹啉几乎全部可提取出，这种方法为最合适的样品前处理方法。

GC-MS检测采用全扫描(SCAN)对样品进行全面定性，再用选择性离子扫描(SIM)对样品中的乙氧基喹啉进行定量检测，有效的排除了杂质的干扰，专属性强，提高了检测的灵敏度，得到更加精确的分析结果。