陈 凯，卿 晶，代德胜，王春玲，魏翠雯，沈桂富

(深圳市中核海得威生物科技有限公司，广东 深圳 518057)

呼气试验是指通过测定呼气成分呼气中的标志气体，实现对身体状态的非侵入性诊断。呼气试验操作简单、容易被受检者接收，研究非常活跃[1]。目前多项呼气试验技术已经应用于临床诊断，如13C-螺旋藻诊断胃排空功能障碍[2]、13/14C-尿素呼气试验诊断幽门螺杆菌感染[3-4]和一氧化氮呼气检测哮喘[5]。其中13/14C-尿素呼气试验诊断幽门螺杆菌感染在临床应用中颇受欢迎，已经成为呼吸内科临床诊断幽门螺杆菌感染的主流方案。

肝脏担负着多种重要的生化功能，是人体最重要的代谢器官之一，肝功能准确性测定有重要的临床意义。目前常用的检测方法包括药物动力学试验、血液生化检查等。鉴于13/14C-尿素呼气试验在市场推广中取得了巨大的成功，13C-标记化合物呼气试验检测肝功能成为一个新的研究热点。在目前报道研究中，科研工作者试验了多种标记化合物，例如：美沙西汀-甲氧基-13C[6-7]、13C-氨基比林[8]、L-[1-13C]-苯丙氨酸[9]等，其中美沙西汀-甲氧基-13C较其他的标记化合物具有用量小、代谢快、适用性广等优点，是研究最活跃的肝功能呼气试验底物。鉴于美沙西汀-甲氧基-13C呼气试验的特点，近些年关于美沙西汀-甲氧基-13C检测肝功能的临床实验和研究论文日趋增多，多项临床实验处于临床Ⅱ期和临床Ⅲ期。

本研究旨在研究以甲醇-13C为标记试剂合成美沙西汀-甲氧基-13C的工艺路线参数。本文以Williamson反应作为关键反应，配合简单的官能团转化高效合成了美沙西汀-甲氧基-13C。该合成路线标记产物纯度高，同位素标记试剂甲醇-13C利用率高，是一种合成美沙西汀-甲氧基-13C的工艺化方案。

1 实 验

1.1 仪器与试剂

仪器：XPE303S型电子天平,梅特勒-托利多；MS7-H550-Pro数显加热磁力搅拌器,大龙兴创实验仪器股份公司；机械搅拌,上海梅颖浦仪器仪表制造有限公司；SHK-Ⅲ循环水式多用真空泵,郑州科泰实验设备有限公司；EYELA东京理化旋转蒸发仪N-1300系列,东京理化器械株式会社；HB-20耐腐蚀隔膜真空泵,上海沪析实业有限公司；Agilent 1260高效液相色谱仪,安捷伦科技有限公司；核磁共振氢谱,布鲁克400 M核磁AVANCE-Ⅲ；检测和高分辨质谱,赛默飞高分辨质谱Q Exactive Focus。

试剂：对乙酰氨基酚(纯度>98%),碳酸钾(纯度>98%)，萨恩化学技术(上海)有限公司；甲醇-13C(纯度>98%，同位素丰度为99atom%13C)、美沙西汀-甲氧基-13C(纯度98.7%，同位素丰度为99atom%13C),剑桥同位素实验室;所有溶剂均为市售化学纯或分析纯试剂，不经处理直接使用。

1.2 试验步骤

将红磷(50 g，1.61 mol)、水(100 mL)投入到带回流装置的反应器中，冷却至-15 ℃，缓慢加入碘(250 g，1 mol)。在-15 ℃条件下缓慢加入甲醇-13C(40.5 mL，1 mol)，将反应体系升温至回流，反应2 h。冷却反应体系，将反应装置更换为蒸馏装置，收集45 ℃左右的冷凝液。

将对乙酰氨基酚(151.0 g，1 mol)溶解于1 L乙腈中，加入碳酸钾(276 g，2 mol)，用机械搅拌搅拌60 min，将上一步骤蒸馏得到的产物缓慢加入反应体系，在35 ℃搅拌12 h。静置反应液，过滤，用乙腈洗涤滤饼。收集滤液后，向滤液中加入100 mL氢氧化钠水溶液(含量为10%)，搅拌10 min后分液。滤液旋干后得到的固体在75 ℃用乙醇溶解，体系恢复室温后用在2～8 ℃放置6 h，过滤得到白色晶体，烘干后称重，计算收率。

1.3 产物表征

产物美沙西汀-甲氧基-13C的核磁共振氢谱如下：1H NMR (400 MHz, Acetone-d6) δ 9.02 (s, 1H), 7.60～7.45 (m, 2H), 6.92～6.75 (m, 2H), 3.92 (s, 2H), 3.56 (s, 2H), 2.03 (s, 3H)。美沙西汀-甲氧基-13C的高分辨质谱数据为ESI-MS: [M+H]+=167.0896，[M+Na]+=189.0716。合成样品的核磁共振氢谱和高分辨质谱均与剑桥同位素实验室购买的对照品一致。核磁共振氢谱显示由于碳13的自旋量子数为1/2，美沙西汀-甲氧基-13C中甲氧基上的三个峰被裂分为d峰。

图1 美沙西汀-甲氧基-13C的核磁共振氢谱Fig.1 1H-NMR of methacetin-methoxy-13C

本文以从剑桥同位素实验室的美沙西汀-甲氧基-13C样品(含量为98.7%)作为对照品。通过分析对照品和合成样品的高效液相数据，推算出合成样品的含量为99.3%。经高分辨质谱检测美沙西汀-甲氧基-13C合成样品的同位素丰度为99.2atom%13C，相对于标记原料丰度未发生明显降低。

2 结果与讨论

2.1 美沙西汀-甲氧基-13C的合成路线

图2 美沙西汀-甲氧基-13C的合成路线Fig.2 Synthetic route of methacetin-methoxy-13C

美沙西汀-甲氧基-13C合成最大的难点是如何活化甲醇-13C中的碳氧键，文献调研显示可首先将甲醇-13C中的碳氧键转化为碳卤键，然后利用Williamson反应合成美沙西汀-甲氧基-13C。Williamson合成醚键时伯卤代烷是效果最佳反应底物，对于一般的烷基醇，反应需要使用强碱，比如NaH、LDA等，而对于酸性较强的酚羟基，使用碳酸钾或者碳酸铯即可。第一步甲醇羟基碘化反应，可使用碘化钾、磷酸将甲醇-13C中的羟基碘化，该方法虽条件温和，但收率不高。因此本文尝试使用红磷、碘将甲醇-13C中的羟基碘化，该方法在操作的时候控制好温度和加料速度，可得到较高收率。接下来本文重点筛选了Williamson的反应条件。

2.2 Williamson反应溶剂的筛选

本文筛选了Williamson反应的反应溶剂。从表一(反应规模为10 mmol，收率以甲醇-13C作为起始物计算)可以发现丙酮和乙腈作为溶剂时反应效果更好，反应总体收率较高(氮氮二甲基甲酰胺也是一种效果好反应溶剂，但由于该溶剂沸点高，最后完全去除的难度较大不利于产物的纯化，本实验没有进行尝试)，常用的乙酸乙酯和二氯甲烷作为溶剂时收率低。丙酮和乙腈的效果均较好，但考虑到丙酮为管制试剂，实验溶剂本文选用了乙腈。

表1 溶剂对反应收率的影响Table 1 Effect of solvent on reaction yield

2.3 Williamson反应温度的筛选

确定了Williamson反应的溶剂之后，本文考察了温度对于合成反应的影响。考虑到碘甲烷的沸点仅有42.5 ℃，温度过高会加速碘甲烷挥发，降低反应收率，因此本实验设定的4个反应温度分别为20 ℃、25 ℃、30 ℃和35 ℃。结果表明反应温度对收率影响较小，对反应时间影响较大。在20 ℃时，反应完全结束需要48 h，而35 ℃时仅需要5 h，可以大大提高效率(反应规模为10 mmol，收率以甲醇-13C作为起始物计算)。

表2 反应温度的筛选Table 2 Screening of reaction temperature

2.4 Williamson反应浓度的筛选

随后本文进行了反应规模放大研究。当反应的量从10 mmol增加到100 mmol时，反应时间从5 h增加到21 h，为了缩短反应时间，本文尝试增加反应液的浓度，实验表明反应时间随着浓度的增大而缩短。考虑到反应体系中含有大量的固体碳酸钾，最终的反应浓度定位1 mol/L。

表3 反应液浓度的筛选Table 3 Screening of reaction solution concentration

2.5 中试工艺及结果

通过Williamson合成方案实验条件的筛选，本文优化好的条件为：碳酸钾做碱；乙腈作反应溶剂；反应温度为35 ℃；反应液浓度为1 mol/L。随后本文进行了放大试验研究，将反应规模放大至1 mol。在产物的纯化过程中，本文使用碱液搅拌分离掉没有参与反应的对乙酰氨基酚，之后在乙醇溶剂中重结晶即可得到美沙西汀结晶品。在放大反应的操作中，每次实验合成阶段的时间约为20 h，后处理与纯化操作的时间约为30 h。

表4 美沙西汀-甲氧基-13C的工艺放大路线及收率Table 4 Process route and yield of methacetin-methoxy-13C

3 结 论

通过对溶剂、温度和浓度等关键实验参数的研究，确定了最优的合成工艺参数，解决了百克级合成美沙西汀-甲氧基-13C的难题。在百克级的合成中，以甲醇-13C为标记原料的总收率在65%左右，产品美沙西汀-甲氧基-13C纯度在99%左右。美沙西汀-甲氧基-13C的同位素丰度相对于标记原料甲醇-13C未发生明显降低。美沙西汀-甲氧基-13C的合成为进一步的呼气试验研究提供了基础。