王 茗，李红霞

(华北理工大学化学与工程学院，河北 唐山 063200)

蛋白质是构成人体组织和器官的重要物质，人们对于蛋白质的研究从未停止。近年来，关于蛋白质-配体间的研究层出不穷，研究方法也不断进步，对于蛋白质的相关研究做出了重大贡献。在讨论蛋白质-配体间作用机制中，光谱法比较常见，且应用广泛，例如：荧光光谱、紫外-可见吸收光谱、圆二色光谱等。同时，等温滴定量热技术也逐渐被应用于这一领域，该技术可以在单个试验中获取蛋白质与配体间结合的结合常数(Ka)、结合位点数(n)以及热力学常数，进一步分析得到作用力类型。分子对接是一种预测蛋白质与配体结合的各种可能的结合构象的技术，根据各个构象和和能量的匹配排名打分，选取最稳定的结合构象。分子对接的出现，对于许多配体-靶标的预测十分重要，对于药物小分子的开发起到了推动作用。

目前，对于蛋白质与小分子作用的光学变化的研究已十分详细，分子对接在药物研发领域的应用十分广发，但对于以溶液状态存在的蛋白质与小分子间的作用机制却没有详尽的综述，所以，本文综述了用于检测溶液中蛋白质与配体相互作用的方法，以方便他人进行研究。

1 光谱法原理及其应用

1.1 荧光光谱法原理

荧光光谱是讨论蛋白质-配体间相互作用的常用方法，通过分析蛋白质-配体体系的发射光谱的数据，可以对反应体系进行热力学分析。小分子配体会对蛋白质的本源荧光产生猝灭作用，这种猝灭作用分为两种，一种是碰撞所致的荧光猝灭，这种猝灭被叫做动态荧光猝灭，另一种是生成基态络合物引发的荧光猝灭，这被称为静态猝灭，另外，还有一种产生碰撞的同时生成络合物的过程，被叫做混合猝灭机制[1]。

1.1.1 猝灭机制

猝灭机制的判断需利用Stern-Volmer方程[2]对数据进行分析，若计算所得KSV值与温度的变化趋势相反，则说明配体与蛋白质间是静态猝灭，并生成了复合物，这是因为升温不利于复合物的稳定性；反之，Ksv值与温度的变化趋势相同，则表明配体与蛋白质之间仅产生了碰撞，这是升温导致碰撞增加所致[3]。此外，若Kq值大于生物大分子与猝灭剂碰撞可达的最大速率常数2×1010L·mol-1·s-1，则说明结合过程中仅存在静态猝灭[4]。

(1)

1.1.2 结合常数和结合位点数

若蛋白质与配体间形成了新的复合物，即配体对蛋白质是静态猝灭，则需要利用双对数方程[5]绘制双对数曲线，得到反应过程中配体和蛋白质之间的结合常数Ka和结合位点数n的值：

(2)

1.1.3 作用力类型

通过Van’t Hoff方程[6]和热力学方程(4)进一步对数据进行分析，可以得到蛋白质与配体间作用的热力学常数：焓变(ΔH0)、熵变(ΔS0)和吉布斯自由能变(ΔG0)。

(3)

ΔG0=ΔH0-TΔS0

(4)

按照ROSS等[7]的分析方法对热力学数据进行分析，即可得到每个络合作用的作用力类型以及驱动力类型。按照ROSS等的研究可知：对于所有相互作用，ΔH0和ΔS0均大于零表明，在反应中起主要作用的是疏水相互作用；ΔH0>0且ΔS0>0表明，氢键或范德华力在相互作用中的作用最明显；ΔH0<0且ΔS0>0表明，静电作用在结合过程中的作用最明显；ΔS0为正值时表明，疏水作用和静电作用在结合过程中的作用最明显；ΔS0<0表明，氢键和范德华力在结合过程中的作用最显著；当ΔH0接近零或很小的时候，主要起作用的是氢键。

1.2 同步荧光和三维荧光法原理

同步荧光和三维荧光光谱常被用来分析蛋白质在反应前后构型是否发生变化的常用手段。其中，将发射波长与激发波长的波长差分别为15 nm和60 nm时，其反映的是蛋白质中酪氨酸和色氨酸周围的结构信息[8]，若是峰位置向长波方向移动，这说明氨基酸残基的极性变强，肽链更加伸展；若是向短波方向移动，这说明氨基酸残基的疏水性增强，肽链更加紧凑[9]。三维荧光可以同时反映激发波长、发射波长和荧光强度的变化，故而其反映的信息更加全面，通过蛋白质三维荧光光谱的变化，可以同时了解到蛋白质肽链和酪氨酸、色氨酸残基的变化[10]。

1.3 紫外-可见吸收光谱法原理

紫外-可见吸收光谱是分析蛋白质-配体相互作用的重要手段之一。蛋白质的紫外吸收光谱中含有两个吸收峰，从220 nm附近的强吸收峰的变化中可以得到蛋白质肽骨架是否发生变化的信息，分析280 nm附近弱吸收峰的改变能够得到芳香族氨基酸是否受到配体络合的影响[10]。如果反应前后蛋白质的谱图发生了变化，则说明蛋白质与配体间形成了新的复合物[11]，若峰位置出现了变化，则表明蛋白质构象也发生了变化[12]。

1.4 圆二色光谱法原理

圆二色技术常被用来讨论蛋白质二级构象的变化。若圆二色光谱中在208～220 nm之间存在两个负峰，且这两个峰呈现出“W”形，则表明是α螺旋结构；若217～220 nm间仅存在一个负峰，且这个峰呈现出“V”形则表明是β折叠结构[13-14]。

1.5 光谱法的应用

由于蛋白质的结构异常复杂，所以一种研究方法往往并不能很好地阐述蛋白质-配体间的作用机制，故而在实际操作中，常常结合上述几种方法进行讨论。张彦青等[15]利用光谱法和分子对接技术对赤藓红与溶菌酶之间的作用进行了研究。光谱法的结果表明：赤藓红对溶菌酶时静态猝灭，并且以摩尔比1:1的比例形成了新的复合物。对荧光光谱的数据进行热力学分析后，得出了在结合过程中疏水作用力和氢键使反应得以发生的结论。分子对接的结果与上述研究一致。王军等[16]采用荧光光谱法、同步荧光光谱法、三维荧光光谱法、紫外光谱法以及分子对接法研究了柠檬黄与牛血清白蛋白(BSA)的相互作用。荧光光谱的结果显示，柠檬黄对BSA是静态猝灭，且1个柠檬黄结合到1个BSA上，且结合能力很强。热力学分析表明，结合过程可自发进行，氢键或范德华力其主要作用。同步荧光和三维荧光的结果指出柠檬黄的加入，改变了BSA的构象，紫外-可见吸收光谱证实了BSA的变化。分子对接结果佐证了光谱法的结果。鄢雨中等[17]利用上述多光谱法结合分子对接技术对芹菜素与大豆分离蛋白之间的相互作用进行了研究。荧光的分析结果表明API对SPI是静态猝灭，氢键或范德华力是相互作用过程中的主要作用力，反应过程自发且放热。同步荧光表明，API的络合，影响了SPI中的Tyr残基和Trp残基周围的极性，其中Tyr残基亲水性变弱，极性减小，相反，Trp残基的亲水性变强，极性增大。三维荧光光谱和圆二色光谱实验表明，API的加入，同时影响了SPI的多肽链结构，其结构较之反应前更加松散，不再紧凑，这也导致SPI表面的亲水性变得更强了。分子对接的结果验证了光谱法的结果。王晓霞等[18]模拟了生理环境，使用上述光谱法和分子对接法对黄腐殖酸(FA)和牛血清白蛋白(BSA)间的相互作用。荧光光谱的结果显示FA对BSA是静态猝灭，且一个FA刚好与1个BSA结合，二者之间的反应可以自发进行，主要存在氢键或范德华力，FA与BSA间存在非辐射能量转移。紫外-可见吸收光谱中出现了最大吸收峰的峰位值向长波长方向移动的现象，说明FA的络合影响了BAS的结构；同步荧光的结果又指出FA的加入对BSA中Trp残基产生了影响，导致其变得比之前更加亲水；三维荧光中两个峰的最大发射波长都出现了不同程度的红移，这表明FA的络合改变了BSA表面的极性，其比之前变得更加亲水了。从这几种光谱的变化得出了FA的络合影响了BSA的构象的结论。圆二色研究和分子对接结果更证明了FA的加入，使BSA中的结构发生了显著变化，其中减少的结构有：α-螺旋结构和无规则结构，分别减少了2.3%和1.2%；增加的结构有β-折叠和β-转角，分别增加了7.7%和0.6%，β-折叠结构含量增加的变化最显著，这一结果强有力地证明了FA使BSA结构发生了改变。

2 等温滴定量热技术原理及其应用

2.1 等温滴定量热技术原理

图1 等温滴定量热原理示意图[19]Fig.1 Schematic diagram of isothermal titration calorimetry[19]

等温量热技术(Isothermal Titration Calorimetry，ITC)是目前唯一可以完整、准确地记录整个反应过程中的热量变化的手段。比起上述光谱法的研究，其结论可信度更高。等温滴定量热技术是将每一滴配体滴定进样品池时产生的热量波动转化为一种维持样品池和参比池温度一样所需的功率量(μcal/s)的形式呈现，这一过程中会将实验过程中出现的热量变化完整地记录下来，再对热量曲线进行积分，即可得到反应的结合常数、结合位点数和相应的热力学数据。同样利用Ross等[7]的方法对热力学常数进行分析，即可得到蛋白质-配体间的作用力类型。

2.2 等温滴定量热技术的应用

肖语涵等[20]利用ITC技术和荧光光谱法对碲化镉量子点(CdTe QDs)与转铁蛋白(transferrin，Tf)的相互作用进行了研究。荧光光谱的结果表明，CdTe QDs与Tf间存在静态猝灭，二者间的结合位点数为0.3，与Tf结合后CdTe QDs的荧光强度增加了。热力学分析的结果显示，二者间可以自发地进行弱结合，同时放出热量，氢键、静电相互作用是这一焓-熵补偿驱动过程的主要推动力，与Tf络合后，CdTe QDs的化学稳定性增强了。智东明等[21]利用ITC对合成的一系列C3H12截短及全长蛋白质与一些潜在的RNA底物ARE9、ARE19及对照Random21结合过程的互作核心区域和热力学性质进行了研究，并以荧光光谱和型热泳动(microscale thermophoresis，MST)技术对ITC的结果验证证。结果显示，C3H12与ARE底物间以1:1的结合比进行结合，过程是自发的，是焓驱动为主的特异性结合。C3H12与ARE19间结和力约为ARE9的两倍。C3H12中ZnF1-3是与ARE类底物结合的活性结构，并且主导了作用的发生。C3H12中的氨基酸残基并未直接与ARE底物直接相互作用。

3 分子对接原理及其应用

3.1 分子对接原理

在蛋白质-配体间的作用研究中，分子对接可以直接将反应过程中的结合位点、结合位点处配体的构象、整个反应中起作用的作用力、氢键是否产生及氢键键长等信息。分子对接技术在药物研发过程中常被用来筛选可以与靶点结合的先导药物[22]，同时在蛋白质-配体的研究中也作为辅助工具，对结合反应的结论进行理论上的验证和补充。

3.2 分子对接的应用

马峥玲等[23]利用分子对接技术探讨了加减薯蓣丸治疗阿尔茨海默病(AD)的药理作用与分子机制。模拟结果表明加减薯蓣丸可能通过减轻炎性反应、抗氧化应激、调节突触可塑性、调控细胞凋亡等多种途径发挥预防及延缓AD进展的效果。唐琳等[24]在模拟生理环境下利用分子对接技术、动力学模拟和光谱法对己烯雌酚(Diethylstilbestrol，DES)与CYP3A4酶的作用机制进行了讨论。荧光光谱表明DES与CYP3A4间存在静态猝灭，红外光谱和紫外-可见吸收光谱显示，DES与CYP3A4的结合，对CYP3A4的内部环境和构象均产生了影响。分子对接和动力学模拟方法从理论上模拟了CYP3A4与DES相互作用后的构象变化情况，理论模拟与实际实验结果互为印证。

4 结 语

与蛋白质相关的研究一直以来备受关注，其中蛋白质与配体间的结合机制更是各领域的热点问题，尤其是在医药领域和食品领域。相关研究方法也一致在进步，而单一的研究方法往往具有局限性，可能会导致结论的可信度不高，而采取几种研究方法相互验证的方式来进行讨论，往往更为大众所接受。在研究以溶液状态存在的蛋白质与配体结合的过程中光谱法、等温滴定量热法和分子对接技术的联合使用，不失为一种好的选择。