姚 畅，田永贵，张 震，吴欣爱，张 毅

1) 郑州大学第一附属医院生物细胞治疗中心 郑州 450052 2) 郑州大学第一附属医院肿瘤中心 郑州 450052 3) 河南省肿瘤免疫和生物治疗重点实验室 郑州 450052 4)郑州大学生命科学学院 郑州 450001

肿瘤免疫疗法是通过改善或增强人体免疫反应来治疗肿瘤的，CD8+T淋巴细胞在清除抗原及抗肿瘤效应中起着重要作用[1]。目前，限制过继性T细胞抗肿瘤疗效的主要原因是回输至患者体内的T细胞多处于终末分化状态，难以发挥持久的杀伤作用[2-3]。研究[4-5]证实，优化CD8+T细胞体外培养体系，延长其体内存活时间并改善其功能，能够增强CD8+T细胞抗肿瘤作用。初始CD8+T细胞(naive CD8+T cell，CD8+Tn)处于静息状态，在被特定的抗原物质激活后，发生增殖并分化形成两种不同功能的细胞，即效应CD8+T细胞(effector CD8+T cell，CD8+Teff)和记忆CD8+T 细胞(memory CD8+T cell，CD8+Tm)。其中，CD8+Tm可分为以下3种：干细胞样记忆性CD8+T细胞(stem-cell memory CD8+T cell，CD8+Tscm)、中心记忆性CD8+T细胞(central memory CD8+T cell，CD8+Tcm)和效应记忆性CD8+T细胞(effector memory CD8+T cell，CD8+Tem)。与CD8+Tem相比，CD8+Tscm和CD8+Tcm具有更强的自我更新能力，可以产生更为迅速且强烈的免疫应答[6-10]。因此，促进CD8+T细胞记忆分化，大量扩增CD8+Tscm或CD8+Tcm亚群是目前改善CD8+T细胞功能方面研究的热点和重点。目前，已有文献[11-12]报道通过基因编辑和添加细胞因子或其他药物延长T细胞存活时间，增加其增殖及抗凋亡能力。

白介素-10(interleukin-10，IL-10)作为免疫抑制因子，具有维持免疫稳态的作用；其还可参与CD8+T细胞记忆形成和活化过程。IL-10可诱导CD62L表达，支持CD8+T细胞归巢[13]，并使CD8+Tm细胞成熟[14]。另外，我们的前期研究[15]证明，二甲双胍可促进CD8+T细胞记忆分化并增加其细胞毒性。本研究通过在体外培养CD8+T细胞时加入人IL-10重组蛋白和二甲双胍，分析CD8+T细胞的记忆分化水平及功能，明确一种新的CD8+T细胞优化培养方案，为CD8+Tm细胞在肿瘤临床转化中的应用提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 主要试剂与仪器人CD8分选磁珠、磁分选缓冲液和LS柱购自德国美天旎公司，胎牛血清购自美国HyClone公司，人CD3/CD28活化磁珠购自美国Thermo Fisher Scientific公司，人IL-2重组蛋白购自北京双鹭药业股份有限公司，人IL-10重组蛋白购自美国Peprotech公司，RPMI 1640培养基、佛波醇12-十四酸酯13-乙酸酯(phorbol 12-myristate 13-acetate，PMA)、二甲双胍等购自美国Sigma公司，离子霉素购自北京索莱宝科技有限公司，CD8-APC-Cy7、CD45RA-PerCP、CD62L-PE、CCR7-APC、CD95-PE-Cy7、CD69-FITC、CD28-FITC、PD-1-PE、LAG-3-APC、IFN-γ-APC、颗粒酶B-FITC、Ki-67-APC流式荧光抗体及布雷杆菌A(brefeldin A solution,BFA)、细胞内染色破膜剂购自美国Biolegend 公司。

1.2 人外周血来源健康供者入选标准：年龄18～40岁;3个月内无感染性疾病，无传染病等其他疾病或病史。排除月经期和妊娠期女性。本研究共收集河南省红十字血液中心4例健康供者的外周血。本研究通过郑州大学第一附属医院医学伦理委员会审批，伦理审批号:2019-KY-258。

1.3 CD8+T细胞的获得用生理盐水将20 mL外周血稀释至30 mL后，缓慢加至15 mL淋巴细胞分离液液面上，2 500 r/min离心25 min，吸取白膜层，得到外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell，PBMC)。将PBMC重悬于磁分选缓冲液中，加入人CD8分选磁珠，4 ℃避光孵育15 min，加入5 mL磁分选缓冲液，离心弃上清，用适量磁分选缓冲液重悬；将LS柱固定在磁场中并用磁分选缓冲液润洗柱子1次，在LS柱中加入细胞悬液，待无液体滴下后用磁分选缓冲液清洗LS柱2～3次，在LS柱内加满磁分选缓冲液，用活塞将柱内的细胞打至新离心管中，离心、弃上清，沉淀即为人CD8+T细胞。

1.4 细胞分组将健康供者外周血获得CD8+T细胞重悬于RPMI 1640培养基(含体积分数10%胎牛血清、50 kU/L人IL-2重组蛋白和人CD3/CD28活化磁珠)中。细胞分4组，分别是对照组(未处理)、IL-10处理组(100 μg/L人IL-10重组蛋白处理7 d)、二甲双胍处理组(200 μmol/L二甲双胍处理7 d)和联合处理组(100 μg/L人IL-10重组蛋白和200 μmol/L 二甲双胍共同处理7 d)，取1×106个/mL的CD8+T细胞悬液0.5 mL铺于48孔板中，处理药物均于铺板时加入，第3天半量更换新鲜RPMI 1640培养基，换液时重新加入对应药物，培养7 d后进行指标检测。

1.5 CD8+T细胞分化及表面标志物的检测每组细胞分为2管，经PBS洗涤后避光加入流式表面抗体CD8-APC-Cy7、CD45RA-PerCP、CD62L-PE、CD95-PE-Cy7、CCR7-APC、CD69-FITC、LAG-3-APC、CD28-FITC和PD-1-PE，每管各加入0.5 μL。4 ℃避光孵育15 min后使用流式细胞仪检测CD8+T细胞记忆亚群比例及表面标志物表达水平，采用BD FACS Diva 8.0.2和FlowjoV10进行分析。CD45RA+CD62L+为CD8+Tn细胞，CD45RA-CD62L+为CD8+Tcm细胞，CD45RA-CD62L-为CD8+Tem细胞，CD45RA+CD62L-为CD8+Teff细胞，在CD8+Tn细胞中圈出CD95+CCR7+双阳性细胞，即CD8+Tscm细胞，计算CD8+Tscm细胞占CD8+Tn细胞的百分比。实验重复4次。

1.6 功能性细胞因子IFN-γ、颗粒酶B和增殖标志物Ki-67表达的检测各组细胞分别加入0.5 μL PMA(50 mg/L)、0.5 μL离子霉素(750 mg/L)和0.5 μL阻断剂BFA，在体积分数5%的CO2、37 ℃恒温培养箱中培养6 h，然后将每组细胞分2管，经PBS洗涤后避光加入0.5 μL表面流式抗体CD8-APC-Cy7，避光4 ℃孵育15 min，每管加入400 μL 40 g/L多聚甲醛重悬细胞，4 ℃避光固定30 min，弃去上清后每管加入1 mL细胞内染色破膜剂，4 ℃避光孵育1 h，1 500 r/min离心5 min，弃上清。每组的2管细胞分别避光加IFN-γ-APC、颗粒酶B-FITC及Ki-67-APC抗体各0.5 μL，4 ℃避光孵育15 min，使用流式细胞仪检测IFN-γ、颗粒酶B和Ki-67的表达情况，采用BD FACS Diva 8.0.2进行分析。实验重复3次。

1.7 统计学处理采用SPSS 21.0进行数据分析，采用2×2析因设计的方差分析比较4组CD8+T细胞记忆分化，细胞表面CD28、CD69、PD-1、LAG-3表达，细胞IFN-γ、颗粒酶B和Ki-67表达的差异，检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 4组CD8+T细胞分化的比较见表1。IL-10处理组CD8+Tcm细胞、CD8+Tn细胞增多，CD8+Tem细胞和CD8+Teff细胞减少；二甲双胍处理组CD8+Tcm细胞增多，CD8+Teff细胞减少。

2.2 4组CD8+Tn细胞中CD8+Tscm细胞占比的比较见表2。IL-10和二甲双胍均可以使CD8+Tscm细胞增多，两者联合有协同作用。

表2 4组CD8+Tn细胞中CD8+Tscm细胞占比的比较(n=4) %

2.3 4组CD8+T细胞表面标志物的比较见表3。IL-10和二甲双胍均可以使CD8+T细胞表面激活型标志CD28、CD69的表达增加，且两者联合对CD69的表达具有协同作用。IL-10和二甲双胍处理对CD8+T细胞表面抑制型标志PD-1、LAG-3的表达无影响。

2.4 4组CD8+T细胞中IFN-γ、颗粒酶B和Ki-67表达的比较见表4。IL-10和二甲双胍均能使CD8+T 细胞功能性细胞因子IFN-γ、颗粒酶B和Ki-67的表达明显增加，且两者联合对Ki-67的表达具有协同作用。

3 讨论

T细胞在清除抗原及抗肿瘤效应中起着重要作用。活化的CD8+T细胞可通过分泌穿孔素、颗粒酶和细胞因子等物质介导肿瘤细胞裂解，发挥其强大的抗肿瘤效应[9-10]。延长CD8+T细胞寿命、促进其增殖和杀伤功能以及减少细胞凋亡可以增强免疫治疗疗效。CD8+Tm细胞通常较为长寿，当它们再次遇到相同的抗原时，能产生更加强烈和迅速的免疫反应，并且比初始反应更有效[1,6-8]。获得分化程度低、体内存活时间长的CD8+T细胞是免疫治疗成功的关键。本研究发现IL-10联合二甲双胍可有效促进CD8+T细胞向记忆亚群CD8+Tcm及CD8+Tscm分化，增强CD8+T细胞抗肿瘤效应。

传统理论认为，IL-10最重要的作用是免疫抑制[16]，它被描述为Th2克隆的分泌型细胞因子合成抑制剂，但是，IL-10的作用具有双面性。研究[13-14,17-18]表明，IL-10不仅在免疫抑制中起重要作用，而且有助于T细胞记忆形成和免疫细胞活化，具体作用取决于特定的细胞类型和环境。研究[13]发现IL-10可以诱导记忆表型CD62L表达，支持CD8+T细胞归巢并保留在次级淋巴器官中。研究[14]发现在淋巴细胞性脉络膜脑膜炎病毒急性感染后，Treg细胞产生的 IL-10对于CD8+Tm细胞的成熟必不可少。西妥昔单抗与IL-10融合蛋白可以通过DC的IL-10受体来调节IFN-γ的产生并减少CD8+TILs的细胞凋亡[19]。Naing等[20]研究发现聚乙二醇化的IL-10可以诱导肿瘤中CD8+T细胞的活化，从而导致IFN-γ、IL-18和颗粒酶B表达增加。本研究结果显示IL-10可有效增加CD8+Tcm细胞、CD8+Tn细胞和CD8+Tscm细胞亚群比例，减少CD8+Tem细胞和CD8+Teff细胞亚群比例，促进表面激活型标志CD28、CD69的表达并有效提高功能性细胞因子IFN-γ、颗粒酶B和增殖标志物Ki-67的表达。

近年来学者们不断深入挖掘二甲双胍在抗肿瘤免疫方面的积极作用。据报道[21-24]，二甲双胍在多种肿瘤中均有抗肿瘤活性，目前已有超过100项临床试验将二甲双胍联合放化疗、免疫治疗等用于肿瘤治疗。二甲双胍可激活AMPK信号通路，增加T细胞脂肪酸氧化水平，从而促进CD8+T细胞记忆分化并延长其生存[25-27]。还有研究[15]发现，与未服药者相比，服用二甲双胍的肺癌患者外周血和肿瘤浸润CD8+Tcm细胞的比例均显著增加；在小鼠移植瘤模型中，当给予二甲双胍处理的HER2 CAR-T细胞治疗时，肿瘤生长明显受到抑制。本研究结果显示二甲双胍处理可有效增加CD8+Tcm和CD8+Tscm比例，增加激活型标志CD28、CD69表达，并有效提高功能性细胞因子IFN-γ、颗粒酶B和增殖标志物Ki-67的表达，而对抑制型标志PD-1、LAG-3无影响。另外，IL-10与二甲双胍联合处理CD8+T细胞时，对CD8+Tscm比例、CD69和Ki-67的表达具有协同作用。

总之，IL-10联合二甲双胍可诱导CD8+T细胞记忆分化，特别是CD8+Tscm亚群的形成，同时增加CD8+T细胞抗肿瘤效应，提示这可能是一种新的获取功能更强的CD8+Tm细胞的体外优化培养体系。