郝倩云，刘壮壮，周斌辉，冯心雨，黄 蓉

1)北京大学肿瘤医院暨北京市肿瘤防治研究所胸部肿瘤内二科，恶性肿瘤发病机制及转化研究教育部重点实验室 北京 100142 2)新乡医学院精神神经医学研究院 河南新乡 453000 3)新乡医学院医学检验学院 河南新乡 453000

骨重塑是一个动态过程，主要包括破骨细胞介导的骨吸收和成骨细胞介导的骨形成[1-2]。近年来抗骨质破坏的研究主要集中在抑制破骨细胞过度激活，而对成骨细胞的研究相对较少。成骨细胞分化对于骨骼生长和骨量维持至关重要，成骨细胞分化和细胞外基质矿化功能障碍最终会导致骨质疏松和骨折等不良临床结局[1-3]。既往有研究[4]报道NF-κB信号通路激活在成骨细胞分化中起促进作用。IKKβ是IKK复合物的主要催化亚基，IKK复合物活化后可磷酸化IκB，导致Iκβ被泛素化并降解，释放NF-κB p65和p50二聚体入核，发挥转录因子的作用[5-6]。前期研究[7]中我们发现成骨细胞中IKKβ缺失显著促进了成骨细胞分化和细胞外基质矿化。本研究通过CRISPR/Cas9基因编辑工具敲除小鼠前成骨细胞MC3T3-E1中的Ikbkb或Rela基因，获得不表达IKKβ或NF-κB p65蛋白的Ikbkb-/-MC3T3-E1和Rela-/-MC3T3-E1细胞，使用β-甘油磷酸(β-glycerophosphate,β-GP)和抗坏血酸(ascorbic acid,AA)[8-9]诱导其分化，观察IKKβ或NF-κB p65缺失对成骨细胞分化的影响，进一步探讨IKK/NF-κB信号通路在成骨细胞分化中的作用，探寻干预成骨细胞分化的靶点。

1 材料与方法

1.1 主要试剂及仪器α-MEM培养基购自美国Gibco公司，胎牛血清购自美国Hyclone公司；β-GP、茜素红购自美国Sigma公司，AA购自北京索莱宝科技有限公司；NF-κB p65、磷酸化NF-κB p65(p-NF-κB p65)、IKKβ抗体购自美国CST公司，ALPL、FZD9抗体购自武汉爱博泰克生物科技有限公司。RNA提取试剂盒RNeasy Plus购自德国Qiagen公司，第一链cDNA合成试剂盒购自美国Thermo Scientific公司，TB GreenTMPremix Ex TaqTM试剂盒购自日本TaKaRa公司。

1.2 基因敲除细胞模型的制备

1.2.1细胞模型制备过程 MC3T3-E1细胞购自中国医学科学院基础医学研究所细胞资源中心，用基础培养基(含体积分数10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 mg/L链霉素的α-MEM培养基)，在37 ℃、体积分数5%CO2条件下培养。利用CRISPR/Cas9基因编辑工具敲除MC3T3-E1细胞中的Ikbkb或Rela基因，获得Ikbkb-/-MC3T3-E1和Rela-/-MC3T3-E1细胞。基因敲除方法[7,10]：通过在线工具CRISPOR[11]设计靶向目的基因外显子的小向导RNA(sgRNA)，用于目的基因靶向载体构建的寡核苷酸序列及其互补序列见表1。使用T4 DNA连接酶将每对寡核苷酸退火、磷酸化并连接至BbsI线性化的pX458-DsRed2或pX458-ECFP载体[10]。后续经过细胞转染、流式细胞仪分选、细胞扩增、基因突变细胞筛选、Sanger测序验证等步骤[7,10]，获得基因敲除模型细胞。

1.2.2模型细胞中IKKβ、NF-κB p65、p-NF-κB p65蛋白表达的检测 采用Western blot法。分别取相同数量的Ikbkb-/-MC3T3-E1和Rela-/-MC3T3-E1细胞，用RIPA裂解液裂解，离心收集上清，按比例加入5×上样缓冲液，100 ℃恒温金属浴变性10 min，进行SDS-PAGE电泳，转蛋白至PVDF膜，50 g/L脱脂奶粉溶液室温封闭1 h，加一抗4 ℃孵育过夜(p-NF-κB p65、NF-κB p65、IKKβ、GAPDH抗体均按1∶1 000稀释)，TBST洗膜5 min×3次，加入HRP标记的二抗(1∶2 000稀释)室温孵育1 h，TBST洗膜5 min×3次，化学发光，曝光成像。采用Image J软件分析目的蛋白和内参GAPDH条带灰度值，两者比值为目的蛋白相对表达量。以MC3T3-E1细胞作对照。

1.3 成骨诱导分化后3种细胞中成骨分化标志物的检测

1.3.13种细胞的成骨诱导分化 将MC3T3-E1、Ikbkb-/-MC3T3-E1和Rela-/-MC3T3-E1细胞分别接种于6孔板内，每孔1×105个，使用基础培养基培养，细胞贴壁24 h后换为成骨培养基(基础培养基+10 mmol/L β-GP+50 mg/L AA)培养。

1.3.2细胞中成骨分化标志性基因mRNA表达水平的测定 细胞经成骨培养基培养4 d后，采用qPCR法检测细胞中Sp7、Alpl、Spp1、Bglap mRNA表达水平[9,12,13-14]。用RNeasy Plus试剂盒提取细胞总RNA(按照说明书操作)，测定RNA浓度和纯度。使用第一链cDNA合成试剂盒进行反转录，得到cDNA。使用TB GreenTMPremix Ex TaqTM试剂盒进行qPCR。按照试剂盒说明书配置反应体系。采用Primer 3在线工具设计引物，见表2。反应条件：95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，40个循环；95 ℃ 15 s，60 ℃ 60 s，95 ℃ 15 s。使用2-ΔΔCT法计算目的mRNA表达水平。以基础培养基培养的细胞作对照。

表2 引物序列

1.3.3细胞中ALPL、FZD9蛋白表达的检测 研究[7,15-16]提示ALPL、FZD9蛋白与成骨细胞分化相关。细胞经成骨培养基培养4 d后，Western blot法检测细胞中ALPL、FZD9蛋白的表达，步骤同前。ALPL、FZD9、GAPDH抗体均按1∶1 000稀释。以基础培养基培养的细胞作对照。

1.4 诱导分化后3种细胞外基质矿化水平的检测细胞在6孔板中经成骨培养基培养16 d后，多聚甲醛固定，去离子水清洗3次，加入10 g/L茜素红室温条件下染色10 min，去离子水洗涤3次后拍照。拍照后每孔加入氯化十六烷吡啶(CPC)800 μL室温洗脱30 min(用以洗脱茜素红染料)，取100 μL洗脱液以等体积的100 g/L CPC稀释，酶标仪测量560 nm波长下的OD值，量化细胞外基质矿化程度。

1.5 统计学处理使用SPSS 22.0完成数据分析。MC3T3-E1和Ikbkb-/-MC3T3-E1细胞中p-NF-κBp65、NF-κB p65蛋白相对表达量，3种细胞普通培养基和成骨培养基培养条件下成骨分化标志性基因和蛋白表达水平的比较采用两独立样本t检验；MC3T3-E1、Ikbkb-/-MC3T3-E1和Rela-/-MC3T3-E1细胞间茜素红染色洗脱液OD值，成骨分化标志性基因和蛋白表达水平的比较采用单因素方差分析，并以Bonferroni法进行组间多重比较；检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 3种细胞中IKKβ、NF-κB p65、p-NF-κB p65蛋白的表达Ikbkb-/-MC3T3-E1细胞中未检测到IKKβ蛋白，Rela-/-MC3T3-E1细胞中未检测到NF-κB p65和p-NF-κB p65蛋白。与MC3T3-E1细胞比较，Ikbkb-/-MC3T3-E1细胞中NF-κB p65磷酸化水平降低，见图1和表3。

1：MC3T3-E1；2：Rela-/- MC3T3-E1；3：Ikbkb-/- MC3T3-E1

2.2 3种细胞中Sp7、Alpl、Spp1、Bglap mRNA表达水平的比较见表4、5。在成骨诱导条件下3种细胞中Sp7、Alpl、Spp1、Bglap mRNA表达水平均高于基础培养基对照。在成骨培养基培养条件下，Ikbkb-/-MC3T3-E1细胞中Sp7、Alpl、Bglap mRNA表达均高于MC3T3-E1细胞和Rela-/-MC3T3-E1细胞，Spp1 mRNA表达水平未见升高。

表4 3种细胞中Sp7、Alpl mRNA表达水平的比较(n=3)

表5 3种细胞中Spp1、Bglap mRNA表达水平的比较(n=3)

2.3 3种细胞中ALPL、FZD9蛋白表达的比较见图2、表6。Ikbkb-/-MC3T3-E1、Rela-/-MC3T3-E1细胞ALPL、FZD9蛋白表达在成骨诱导条件下高于普通培养基对照，且Ikbkb-/-MC3T3-E1细胞中差异更明显。在成骨诱导条件下Ikbkb-/-MC3T3-E1细胞中ALPL、FZD9蛋白表达高于MC3T3-E1细胞和Rela-/-MC3T3-E1细胞。

1：MC3T3-E1；2：Ikbkb-/- MC3T3-E1；3：Rela-/- MC3T3-E1；C：普通培养基；E：成骨培养基

表6 3种细胞中ALPL、FZD9蛋白表达的比较(n=3)

2.4 3种细胞细胞外基质矿化程度的比较茜素红染色结果见图3。MC3T3-E1、Ikbkb-/-MC3T3-E1和Rela-/-MC3T3-E1细胞成骨培养后，经茜素红染色、拍照后洗脱，洗脱液OD值分别为(0.42±0.01)、(1.40±0.05)、(0.32±0.01)，3种细胞比较差异有统计学意义(F=395.056，P<0.001);Ikbkb-/-MC3T3-E1细胞高于MC3T3-E1细胞和Rela-/-MC3T3-E1细胞，而Rela-/-MC3T3-E1与MC3T3-E1细胞比较差异无统计学意义；提示IKKβ缺失促进成骨细胞的分化，而NF-κB p65缺失则无此作用。

图中标尺500 μm；A：MC3T3-E1细胞；B：Ikbkb-/- MC3T3-E1细胞；C：Rela-/- MC3T3-E1细胞

3 讨论

已有研究[17-19]证实，IKK/NF-κB信号通路促进破骨细胞分化。然而对于IKK/NF-κB信号通路对成骨细胞分化的调控仍缺乏研究，既往研究的结论也不一致。Chang等[12]通过建立成骨细胞中不表达IKKγ的小鼠遗传学模型，证明IKK/NF-κB信号通路抑制时小鼠的骨质量、骨矿物质密度、骨形成速率和成骨细胞分化标志基因的表达增加。但也有研究报道NF-κB激活在成骨细胞分化中起促进作用。例如Wang等[4]研究发现野黄芩苷通过激活NF-κB p65促进成骨细胞分化和增殖，黄芩苷以剂量依赖性方式增加NF-κB p65磷酸化水平，p65抑制剂可阻止野黄芩苷诱导的成骨细胞增殖和分化。IKK/NF-κB信号通路如何调控成骨细胞分化的机制仍不明确。

本研究中，我们采用CRISPR/Cas9基因编辑技术获得了不表达IKKβ的Ikbkb-/-MC3T3-E1细胞和不表达NF-κB p65的Rela-/-MC3T3-E1细胞，Ikbkb-/-MC3T3-E1细胞中NF-κB p65磷酸化水平低于MC3T3-E1细胞。我们进一步检测了基础培养基和成骨培养基培养后MC3T3-E1、Ikbkb-/-MC3T3-E1、Rela-/-MC3T3-E1这3种细胞中成骨细胞分化标志性基因Sp7、Alpl、Spp1和Bglap的mRNA和成骨分化相关蛋白ALPL、FZD9的表达。结果显示：基础培养基培养后Ikbkb-/-MC3T3-E1、Rela-/-MC3T3-E1细胞中Bglap mRNA表达水平高于MC3T3-E1细胞；Ikbkb-/-MC3T3-E1细胞中Sp7、Alpl mRNA表达水平高于MC3T3-E1和Rela-/-MC3T3-E1细胞，而Bglap mRNA表达水平低于Rela-/-MC3T3-E1细胞；3种细胞中ALPL蛋白表达差异无统计学意义。成骨培养基培养后Ikbkb-/-MC3T3-E1细胞中Sp7、Alpl、Bglap mRNA和ALPL、FZD9蛋白表达，以及细胞外基质矿化水平均高于MC3T3-E1细胞和Rela-/-MC3T3-E1细胞。

本研究结果显示IKKβ缺失抑制了成骨细胞中NF-κB p65的磷酸化，促进了成骨细胞的分化，NF-κB p65缺失没有明显的促成骨细胞分化的作用，IKKβ缺失和NF-κB p65缺失对成骨细胞分化的影响存在差异，可能与差异调控成骨分化相关基因的表达有关。这说明IKKβ缺失促进成骨细胞分化并非完全是通过抑制NF-κB p65活性实现的。既往研究[6,20-21]报道IKKβ除了激活经典的NF-κB信号通路外，还存在其他的磷酸化底物，包括IRF5、DOK1等。在成骨细胞分化过程中IKKβ可能具有更多亟待探索的功能。

总之，本研究发现IKKβ缺失可显著促进成骨细胞的分化，而NF-κB p65缺失没有明显的促成骨细胞分化的作用。IKKβ虽然参与NF-κB p65蛋白的激活，但IKKβ和NF-κB p65在成骨细胞分化过程中的功能存在差异，进一步研究IKKβ调控成骨细胞分化的功能和机制有助于准确选择干预成骨分化的靶点。