肖旭阳，杜天宇，周 玄，王立坤

锦州医科大学附属第一医院胸外科 辽宁锦州 121000

肺癌是全世界发病率和病死率较高的恶性肿瘤，发生机制涉及多因素、多基因和多阶段[1-2]。有研究[3-4]发现肺癌组织中miR-184表达上调，与肿瘤TNM分期、病理分化级别、淋巴结转移、浸润深度以及患者生存预后有关，认为miR-184表达异常参与了肺癌的发生和发展。顺铂化疗是肺癌的主要治疗方案，但约30%初次以及70%以上多次顺铂化疗的患者表现出药物抵抗，是化疗失败的主要原因[5]。顺铂耐药性与肿瘤细胞耐药基因表达、DNA损伤修复能力、细胞信号通路活性等密切相关[6]。PI3K/AKT/mTOR信号通路在调控细胞增殖、分化、侵袭、细胞周期、血管再生、能量代谢等方面发挥重要作用，参与多种生理或病理过程[7-8]。该研究检测顺铂耐药的肺癌细胞中miR-184和 PI3K/AKT/mTOR信号通路蛋白的表达，探讨miR-184异常表达与PI3K/AKT/mTOR信号通路激活的关系，为肺癌的顺铂耐药机制研究提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 主要试剂与仪器DMEM培养基(美国Gibco公司)，顺铂、MTT试剂盒、G418溶液、Lipofectamine 2000转染试剂(美国Sigma公司)，分光光度计(美国Bio-Rad Laboratories公司)，Trizol试剂、细胞凋亡试剂盒(美国Invitrogen公司)，反转录试剂盒(美国Applied Biosystems公司)，SYBR Premix Ex TaqTM试剂盒(日本TaKaRa Bio公司)，流式细胞仪(美国Beckman Coulter公司)，细胞蛋白裂解缓冲液和BCA蛋白测定试剂盒(江苏碧云天生物有限公司)，PVDF膜(美国Millipore公司)，兔抗人PI3K、AKT、mTOR、β-actin一抗和羊抗兔辣根过氧化物酶偶联二抗(美国Santa Cruz公司)，ECL化学发光试剂(美国Pierce Biotechnology公司)。

1.2 细胞来源及培养人肺腺癌A549和鳞癌SKMES1细胞系由锦州医科大学实验中心提供，用含体积分数10%胎牛血清和青链霉素双抗的DMEM培养基，于37 ℃、体积分数5%CO2细胞培养箱中培养，隔天换液，待细胞生长融合度达到70%时传代。取2～3代对数生长期细胞，胰蛋白酶消化，PBS液重悬细胞，调密度为2×106个/mL分装备用。

1.3 顺铂耐药细胞模型的建立和筛选采用反复刺激、逐渐增加顺铂药物浓度的方法[6]建立耐药细胞模型。首先采用0.1 mg/L顺铂刺激对数生长期肺癌细胞48 h，待细胞贴壁生长至80%融合后换用0.2 mg/L顺铂继续培养48 h，顺铂浓度每次增加0.1 mg/L直至1.0 mg/L。1.0 mg/L顺铂继续刺激细胞48 h后终止培养，胰蛋白酶消化，PBS液重悬细胞。

采用MTT法检测细胞增殖活性，筛选能稳定耐药的传代细胞。将上述细胞转移至96孔板，每孔接种2×106个，正常DMEM培养基培养48 h。根据MTT试剂盒说明书先加入MTT溶液20 μL避光孵育4 h，加入DMSO溶液150 μL 37 ℃温育10 min，使用分光光度计检测490 nm波长的吸光度值，绘制剂量-反应曲线。最终筛选出耐药细胞增殖率达到稳定状态[6]的耐药细胞模型。

1.4 miR-184过表达和低表达细胞的构建过表达miR-184耐药细胞的构建：从NCBI基因库检索miR-184序列，设计合成引物序列，上游5’-CGG GATCCATGTCAAACGTGCGAGTGTCTAACG-3’，酶切位点为BamHⅠ，下游5’-CGGAATTCTTACGTTT GACGTCTTCTGAGGCCAG-3’，酶切位点为EcoRⅠ。PCR反应体系包括10×Buffer 2 μL+MgSO42 μL+dNTPs 2 μL+上、下游引物各1 μL+cDNA 2 μL，用无RNase的ddH2O补足体系至20 μL。反应条件为95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s、64 ℃ 30 s、72 ℃ 45 s，共34个循环；72 ℃ 5 min。经胶回收、酶切片段和pCDNA 3.0-Flag连接6 h转化，DH5α摇菌，Taq酶进行菌液PCR扩增，将酶切鉴定的阳性质粒测序，最后利用Lipofectamine 2000转染试剂将其转染入耐药模型细胞，4 h换液1次，48 h后加入500 mg/L G418溶液培养1个月，获得稳定过表达miR-184的耐药细胞。

低表达miR-184耐药细胞的构建：设计合成miR-184干扰序列，上游5’-GGCATGAACCTG GCATACAAT-3’，下游5’-TTCTCCGAACGTGT CACGT-3’，PCR反应体系和反应条件及质粒转染同上。采用qRT-PCR检测miR-184的表达量。Trizol试剂一步法提取细胞中RNA，根据Taq Man反转录试剂盒要求合成cDNA；使用Prime Script RT试剂盒和SYBR Premix Ex TaqTM试剂盒提示配制PCR扩增体系，总体积20 μL，包括miR-184上、下游引物，双蒸水补足体系；反应条件：95 ℃ 5 min预变性；95 ℃变性30 s、64 ℃ 退火30 s，72 ℃ 延伸30 s，40个循环后制作熔解曲线。以2-ΔΔCt法计算目的基因的相对表达水平。实验重复6次。

1.5 细胞增殖、凋亡和PI3K/AKT/mTOR蛋白表达的检测

1.5.1实验分组 实验分为对照组、耐药组、过表达组和低表达组。对照组为未处理的肺癌A549和SKMES1细胞，耐药组、过表达组和低表达组分别为耐药模型细胞、1.4构建的过表达和低表达miR-184的耐药细胞。每组设6个复孔。

1.5.2细胞增殖率检测 MTT法(同1.3)检测培养24、48和72 h的细胞增殖率。

1.5.3细胞凋亡率的检测 采用Annexin V-FITC/PI双染法。取对数生长期细胞(2×106个/mL)1 mL接种至96孔细胞培养板上，室温培养24、48和72 h，根据Annexin V-FITC/PI细胞凋亡试剂盒说明书进行处理，PBS液300 μL重悬细胞，室温避光条件下加入5 μL Annexin V和5 μL PI染色15 min，4 h内使用流式细胞仪检测细胞凋亡率。

1.5.4细胞PI3K、AKT和mTOR蛋白的检测 取4组对数生长期细胞(2×106个/mL)1 mL接种至96孔细胞培养板上，培养72 h，加入细胞裂解缓冲液提取细胞总蛋白，BCA蛋白测定试剂盒检测浓度和纯度，以内参β-actin抗体对样品蛋白进行剂量标准化处理。每组取30 μg样品蛋白和等量标准蛋白经100 g/L SDS-PAGE电泳分离，带电转移到PVDF膜，加入5 g/L脱脂奶粉封闭抗体1 h，加入兔抗人PI3K、AKT、mTOR和β-actin一抗(均按1∶1 000稀释)4 ℃避光过夜孵育，TBST洗涤3次×10 min，加入羊抗兔辣根过氧化物酶偶联二抗(按1∶300稀释)37 ℃避光孵育4 h。TBST洗涤3次×10 min，加入ECL化学发光试剂使蛋白条带可视化，经Quantity One 4.62软件自动分析谱带强度。以目的蛋白与内参蛋白条带灰度值的比值表示目的蛋白的表达水平。

1.6 统计学处理采用SPSS 20.0软件进行分析，4组细胞miR-184和PI3K、AKT、mTOR蛋白表达水平以及细胞增殖率、凋亡率的比较采单因素方差分析和LSD-t检验。检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 4组细胞miR-184表达的比较耐药组A549和SKMES1细胞中miR-184表达水平高于对照组，过表达组高于耐药组，低表达组低于耐药组，见表1。

表1 4组细胞miR-184表达的比较

2.2 4组细胞增殖率的比较见表2。与对照组比较，耐药组A549和SKMES1细胞增殖率升高；与耐药组比较，过表达组细胞增殖率升高，低表达组降低。

2.3 4组细胞凋亡率的比较见表3。与对照组比较，耐药组A549和SKMES1细胞凋亡率降低；与耐药组比较，过表达组细胞凋亡率降低，而低表达组升高。

2.4 4组细胞PI3K、AKT和mTOR蛋白表达的比较见图1和表4。与对照组比较，耐药组A549和SKMES1细胞PI3K、AKT和mTOR蛋白的表达水平升高；与耐药组比较，过表达组细胞PI3K、AKT和mTOR蛋白的表达水平升高，而低表达组降低。

1～4：分别为对照组、耐药组、过表达组和低表达组

表4 4组细胞PI3K、AKT和mTOR蛋白表达水平的比较

3 讨论

刘柳等[9]指出，外泌体 miR-184参与了乳腺癌骨转移的发生与发展，早期检测对乳腺癌患者骨转移有预测价值。Fang等[10]发现miR-184与UCA1能够相互作用，在影响肿瘤细胞增殖和顺铂敏感性方面发挥重要作用，同时也指出miR-184低表达能够诱导顺铂抵抗。Zhu等[11]的研究表明，miR-184可以通过靶向调节下游细胞信号通路中关键蛋白Notch2的表达，进而抑制鼻咽癌的侵袭和转移能力。王蕾等[12]的研究指出，血清外泌体miR-184在非小细胞肺癌中呈高表达，临床诊断效能较高，可能成为非小细胞肺癌早期诊断的生物学标志物。

肺癌发生顺铂化疗抵抗是较常见的临床现象，是导致患者生存预后不佳的重要不利因素。有研究[13]发现顺铂抵抗的肺癌细胞中miR-184表达异常上调。本研究结果表明，耐药组A549和SKMES1细胞中miR-184表达水平高于对照组，提示miR-184表达上调参与了肺癌顺铂耐药的发生。陈力等[14]认为E6癌蛋白可以通过降低miR-184表达，增加肺癌细胞中抗凋亡蛋白Bcl-2表达活性，使其表现为顺铂耐药。Zheng等[15]研究证实，肿瘤相关巨噬细胞来源miR-21在胃癌细胞中向细胞外转移，可能是胃癌细胞对顺铂产生耐药性的重要原因。Zhu等[16]研究指出，miR-187通过调节TGF-β/Smad信号通路活性来影响胃癌细胞的顺铂耐药性。Lu等[17]研究发现miR-424能够通过靶向调控SMURF1基因表达，进而影响胃癌的顺铂耐药性。Wei等[18]研究指出，miR-362-5p可增强胃癌细胞对顺铂的敏感性。

本研究结果表明耐药组A549和SKMES1细胞增殖率高于对照组，过表达组高于耐药组，而低表达组低于耐药组，推测miR-184表达上调能够增强耐药肺癌细胞的增殖活性。耐药组A549和SKMES1细胞凋亡率低于对照组，过表达组低于耐药组，而低表达组高于耐药组，推测miR-184表达上调能够抑制肺癌细胞的凋亡活性。

PI3K/AKT/mTOR信号通路是调控肿瘤细胞增殖、迁移、侵袭和化疗耐药的主要途径之一，AKT磷酸化后能够激活一氧化氮合酶，促进肿瘤局部微血管形成[19]。AKT上丝氨酸和苏氨酸残基磷酸化是其完全活化的必需条件[20]。PI3K属于细胞内磷脂酰肌醇激酶，其活性增加与多种肿瘤发生相关[21]。mTOR是一种保守丝氨酸/苏氨酸激酶，是AKT下游通路的主要靶点，可以影响多种与肿瘤发生相关的基因或蛋白的表达[22]。mTOR作为参与调控肿瘤发生的关键调节因子，通过磷酸化核糖体蛋白S6激酶和翻译真核起始因子4E结合蛋白1等，刺激蛋白质合成，调节细胞生长和增殖、细胞代谢、血管生成等生理和病理过程[23]。本研究结果表明耐药组A549和SKMES1细胞PI3K、AKT和mTOR蛋白表达水平高于对照组，过表达组高于耐药组，而低表达组低于耐药组，推测肺癌细胞PI3K、AKT和mTOR蛋白表达水平升高与顺铂耐药密切相关，同时miR-184表达上调可能通过激活PI3K/AKT/mTOR细胞信号通路，进而增强顺铂耐药性。

综上所述，miR-184可促进顺铂耐药肺癌细胞增殖，抑制细胞凋亡，与PI3K/AKT/mTOR细胞通路的激活密切相关。