岳阳丽，刘翠丽，贺贵天，马贵霞

郑州大学第一附属医院牙体牙髓科 郑州 450052

龋病是最常见的口腔疾病。龋损形成是脱矿与再脱矿的持续性动力学反应，当脱矿作用大于再矿化作用时就会出现矿物质的持续丢失继而产生龋损[1-2]。因此，促进钙、磷等矿物质沉积于正常或脱矿牙体硬组织中的再矿化是抑制龋损发生的有效途径。

生物活性玻璃(bioactive glass,BAG)是一种以SiO2-CaO-Na2O-P2O5为基础的硅酸盐类材料[3]。BAG在液体环境中能够快速释放Ca2+、PO43-，与液体中的H3O+进行离子交换，迅速提高周围溶液的pH值，而后在材料表面形成大量Si(OH)4，Si-OH基团缩聚，经过离子迁移过程，最终生成羟基磷灰石(hydroxyapatite,HAP)层。BioMinF和奥敏清均为45S5型BAG。已有学者[4]证实两者可促进脱矿牙釉质再矿化，但在牙本质再矿化方面的研究较少。本实验采用Micro-CT分析BioMinF和奥敏清对人工牙本质龋再矿化的影响，探索BAG和氟化物的联合使用对牙本质龋再矿化的影响。

1 材料与方法

1.1 主要试剂与仪器BioMinF粉末(英国Biomin技术有限公司)，奥敏清粉末(D90，北京大清生物有限公司)，氟化钠、醋酸、氯化钙、氯化钾、磷酸二氢钾、碳酸氢钠(分析纯，北京谨明生物科技有限公司)，4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙烷磺酸(HEPES，美国Anresco公司)，氯铵T(分析纯，天津市光复精细化工研究所)，去离子水(希之梦商贸有限公司)，红色指甲油(广州爱琳公司)。

去离子水溶解适量氟化钠配制成20 g/L的氟化钠溶液；酸性脱矿液由2.2 mmol/L 氯化钙、2.2 mmol/L磷酸二氢钾和50 mmol/L醋酸组成；酸性缓冲液：1.5 mmol/L氯化钙、0.9 mmol/L磷酸二氢钾和50 mmol/L醋酸混合，加入碳酸氢钠调节pH至4.5；中性缓冲液由20 mmol/L HEPES、1.5 mmol/L氯化钙，0.9 mmol/L磷酸二氢钾和150 mmol/L氯化钾混合，加入碳酸氢钠调节pH至7.0。

低速精密切割机(明兹精密仪器上海有限公司)，恒温水浴箱(北京长安科学仪器厂)，Micro-CT系统(德国Bruker公司)。

1.2 样本制备收集完整无龋坏的新鲜离体人第三磨牙40颗，储存于4 ℃氯铵T溶液中。使用低速精密切割机在釉牙骨质界上方1.0 mm处以垂直于牙体长轴的方向切割，最后制成6 mm×3 mm×1 mm大小的牙本质块，并用SiC砂纸打磨抛光至4 000目，使其形成平整、光滑的平面，超声荡洗10 min。

将每个样本的表面等分为3个3 mm×2 mm的小区域，分别命名为a、b和c区。a区为单纯脱矿区，仅脱矿处理；b区是再矿化区，进行脱矿和再矿化处理；c区是对照区，为正常牙本质，不进行脱矿和再矿化处理[5]。除a和b区外，其他地方均涂布抗酸指甲油，干透后涂布第2层(图1A)。然后将上述样本置于pH 4.5的酸性脱矿液中96 h，每24 h换液1次。脱矿完成后，去离子水冲洗，并用抗酸指甲油覆盖样本的a区，干透后涂布第2层，以保持其单纯脱矿状态(图1B)。

A:脱矿前;B:脱矿后

1.3 实验分组与处理将制备好的样本随机分为4组，BioMinF组(A组)、奥敏清(B组)、奥敏清+氟化钠(C组)、氟化钠(D组)，每组10个样本。A、B组分别用含去离子水的湿润小毛刷蘸取BioMinF或奥敏清粉末均匀涂抹于样本b区，静置5 min,去离子水冲洗，再浸入去离子水中5 min；C组用含有去离子水的湿润小毛刷蘸取奥敏清粉末均匀涂抹于b区，静置5 min，去离子水冲洗，再浸入20 g/L 氟化钠溶液中5 min；D组浸入20 g/L氟化钠溶液中5 min，去离子水冲洗，再浸入去离子水中5 min。各组经上述处理后，去离子水冲洗，于37 ℃恒温水浴箱中进行pH循环：酸性缓冲液作用30 min，中性缓冲液作用10 min。以上为一次再矿化流程，而后进入下一个再矿化流程。每d 6次，共8 d。

1.4 Micro-CT检测pH循环结束后，去除指甲油、冲洗，将样本置于Micro-CT中，在100 kV、80 kA、9 μm层厚条件下进行扫描，三维重建。重建后使用Dataviewer软件保存样本冠状面数据，使用CT Analyzer软件进行可视化分析。扫描2个羟基磷灰石块体模(250 mg/cm3和750 mg/cm3)，用于矿物质密度值校正。在每个样本a、b、c区各随机选择2个302 μm×302 μm大小的二维感兴趣区域(volume of interest,VOI)测定矿物质密度(dentin mineral density,DMD)。绘制每个样本3个区域VOI的DMD随深度变化的曲线。

在每个样本a、b区分别选择2个302 μm× 302 μm×225 μm大小的三维VOI测定DMD。ΔDMD=DMDb-DMDa。

从每个样本重建的3D图像中，随机截取5个矢状面图像，测量a和b区域的病损深度(lesion depth,LD)，取均值。ΔLD=LDa-LDb。

1.5 统计学处理釆用SPSS 21.0分析。4组ΔDMD和ΔLD差异的比较采用单因素方差分析和LSD-t检验，检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 4组DMD-深度曲线4组a、b、c 3个区域典型的DMD-深度的变化曲线见图1。在同一病损深度，各组b区的DMD均高于a区。随着病损深度的增加，DMD增幅减小，在牙本质表层下0～150 μm范围内DMD值的增幅较大，而在表层下150～300 μm的深度内DMD值的增幅较小。A、B、C 3组b区牙本质病损表层的DMD接近于c区表层的DMD；D组b区牙本质病损表层的DMD则小于c区。

A、B、C、D：分别为A、B、C、D组

2.2 4组ΔDMD比较见表1。4组ΔDMD比较，差异有统计学意义，C组大于A组和B组，D组小于A组和B组。

表1 4组ΔDMD的比较 mg/cm3

2.3 4组ΔLD比较见表2。4组ΔLD比较，差异有统计学意义，C组大于B组，B组大于A组，A组大于D组。

表2 4组ΔLD的比较 μm

3 讨论

BioMinF是一种新型的含氟45S5型BAG，它与水、唾液或其他人液体环境接触后，经五个无机化学相反应，最终生成氟磷灰石，堵塞牙本质小管，缓解牙本质敏感症状[6-8]，而且BioMinF能缓慢释放F-、Ca2+和PO43-，有效地减少牙齿脱矿、促进牙体硬组织再矿化[9]，有效抑制人工早期釉质龋的发展。奥敏清是一种不含氟的45S5型BAG，它能在唾液环境下发生迅速、持续的反应，释放Ca2+、PO43-成分，最终生成HAP层，使牙本质实现再矿化[3,10]。

DMD值是评价矿物含量变化的一个重要指标。Micro-CT是高分辨率3D X射线成像技术，该图像分析方法可检测牙体硬组织不同部位的DMD变化[11]。本实验采用Micro-CT测定牙本质块不同区域内的DMD并计算差值，分析牙本质矿物含量的变化及牙本质再矿化的程度。为了避免不同牙齿牙本质块质地差异的影响，本实验采用在同一牙本质块上涂布指甲油进行分区[12]。

本研究结果显示，4组样本再矿化处理后病损部位的DMD均升高；随着病损深度的增加，DMD增幅减小，病损最深部的DMD几乎没有变化。这一结果表明BAG与氟化钠的矿物质沉积特点一致，即距离病损表层越远，离子越难到达，因此再矿化作用越弱。但在牙本质病损表层，A、B、C 3组样本再矿化b区的DMD接近于正常c区，D组样本再矿化b区的DMD则小于正常c区，提示BioMinF和奥敏清在牙本质表层的再矿化作用优于氟化钠。

再矿化后各组的ΔDMD均值分别为70.19、72.83、87.93、60.22 mg/cm3，提示4种再矿化处理方式均可在一定程度上促进脱矿牙本质再矿化。C组ΔDMD最大，提示奥敏清与氟化钠联合作用后矿物质含量增加最多；A组和B组ΔDMD差异无统计学意义，提示BioMinF与奥敏清在增加矿物质含量方面作用无差异。D组的ΔDMD最小，提示氟化钠作用最弱。

ΔLD越大，提示再矿化效果越好。各组ΔLD均值分别为40.53、48.91、52.08、33.42 μm，这一变化趋势与ΔDMD的变化一致，提示奥敏清与氟化钠联合作用导致的病损深度变化最大，而奥敏清在此方面的作用略优于BioMinF，氟化钠组作用最弱。

本实验中奥敏清和氟化钠的联合使用显示出最好的再矿化效果，这与陈丽薇等[13]的研究结果相似，他们发现奥敏清和氟化物涂膜联合使用堵塞牙本质小管的效果最佳，且具有较好的抗酸性和抗洗刷性能。可能原因如下：①奥敏清所形成的矿物质沉积物为氟化钠溶液的附着提供了支架，增加了其与牙本质表面的接触面积。②奥敏清能在唾液环境下发生迅速、持续的反应，释放大量的Ca2+、PO43-，氟化钠与Ca2+、PO43-发生反应在牙本质表面形成球状CaF2层，进而形成HAP和氟磷灰石晶体。BioMinF只含有少量的氟元素，可能不足以使其在牙本质表面形成大量的氟磷灰石。本研究结果提示BioMinF和奥敏清均能促进牙本质再矿化，BioMinF中由于含氟量低微，并未显示出其成分优势。另外两者作用的差异也可能与两种物质的硅酸盐网络结构、钙磷含量的成分、制作工艺等不同有关。

综上所述，BioMinF、奥敏清都能够促使牙本质发生再矿化，且它们与氟化钠的矿物质沉积特点一致。奥敏清和氟化钠联合使用的效果优于BioMinF和奥敏清单独应用，提示奥敏清和氟化物在牙本质再矿化作用中具有协同作用，但可能存在剂量依赖性，这有待于后期的进一步研究。