汪小雪，梁红玉，刘贝贝，李文杰，刘欣欣

郑州大学公共卫生学院营养与食品卫生学教研室 郑州 450001

近年来，随着生活方式的改变以及人口老龄化，糖尿病患病率不断增加，由糖尿病引起的认知功能障碍也受到了广泛的关注[1-3]。糖尿病认知功能障碍的发病机制目前还不清楚，有研究[4-5]表明可能与β-淀粉样蛋白(β-amyloid,Aβ)异常沉积形成老年斑、慢性炎症以及大量神经元凋亡有关。紫檀芪(pterostilbene，PTE)作为非黄酮类多酚化合物，来源于蓝莓、葡萄等浆果中，具有抗氧化、抗炎、抗癌等作用[6-8]。已有研究[9]表明PTE对认知损伤具有一定改善作用，但是作用机制目前研究的较少。本研究通过观察2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus,T2DM)大鼠学习记忆能力变化，检测大鼠海马组织中Aβ、炎症因子以及PI3K/AKT信号通路相关蛋白表达水平，探讨PTE对T2DM大鼠认知功能的影响及可能的作用机制。

1 材料及方法

1.1 材料4周龄雄性SD大鼠60只，质量90～110 g，购自河南省实验动物中心[许可证号：SCXK(豫)2017-0001]，在郑州大学公共卫生学院实验动物中心饲养。PTE购自上海士丰生物有限公司，链脲佐菌素购自美国Sigma公司，羧甲基纤维素钠购自北京索莱宝生物科技有限公司，PI3K/AKT信号通路相关蛋白(PI3K、p-AKT、AKT、Bcl-2、Bax和Caspase-3)抗体购自北京博奥森有限公司，ELISA试剂盒购自上海抚生实业有限公司，电泳仪购自北京六一生物科技有限公司，化学发光成像仪购自美国Syugene公司，Biotek酶标仪购自美国Bio-Rad公司。

1.2 T2DM大鼠模型的建立和分组60只大鼠适应性喂养7 d后，采用随机数字表法抽取10只大鼠作为正常对照组；其余50只大鼠喂养高脂高糖饲料，按照文献[10]方法建立T2DM大鼠模型。选取造模成功的大鼠40只，随机分为T2DM组、PTE低剂量组、PTE中剂量组、PTE高剂量组4组(n=10)。3个PTE剂量组分别按照20、40、80 mg/kg的剂量灌胃，T2DM组和正常对照组灌胃羧甲基纤维素钠溶液，1次/d，连续干预12周。

1.3 大鼠学习记忆能力检测12周后，进行Morris水迷宫实验。实验共历时6 d，第1～4天隐藏平台进行定位航行实验，记录大鼠逃避潜伏期；第6天撤掉平台进行空间探索实验，记录大鼠穿越平台次数。

1.4 海马组织形态学观察水迷宫实验结束后，腹主动脉采血处死大鼠，剥离海马组织。取一侧海马组织放入 40 g/L多聚甲醛溶液中进行固定，石蜡包埋，4 μm厚切片，进行常规HE染色观察。

1.5 海马组织中Aβ1-40、Aβ1-42、IL-1β、IL-6、TNF-α水平的检测取适量海马组织制作匀浆，取上清液。按照ELISA试剂盒操作说明书步骤检测海马组织中Aβ1-40、Aβ1-42和IL-1β、IL-6、TNF-α水平。

1.6 海马组织中PI3K/AKT信号通路相关蛋白表达水平的检测取适量海马组织制作匀浆，取上清液。通过BCA法检测总蛋白的浓度，根据测定的浓度按30 μg上样量上样，60 V 30 min浓缩胶电泳，100 V 60 min分离胶电泳；继续用三明治夹心法进行转膜，转膜条件250 mA 120 min；再用50 g/L脱脂奶粉液37 ℃封闭90 min，TBST洗膜10 min；加一抗4 ℃孵育过夜，TBST洗膜3次，10 min/次；加二抗室温摇床孵育2 h，TBST洗膜3次，10 min/次；用ECL化学发光试剂盒进行显影，用Image J软件进行分析。

1.7 统计学处理采用SPSS 25.0分析数据；应用重复测量数据的方差分析比较各组大鼠逃避潜伏期的差异，应用单因素方差分析和LSD-t检验比较各组大鼠穿越平台次数，大鼠海马组织中Aβ1-40、Aβ1-42和IL-1β、IL-6、TNF-α以及PI3K/AKT信号通路相关蛋白表达水平的差异。检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 各组大鼠学习记忆能力的比较见表1。定位航行实验中各组大鼠逃避潜伏期差异有统计学意义(P<0.05)。空间探索实验结果显示各组大鼠穿越平台次数差异有统计学意义(P<0.05)；与正常对照组相比，T2DM组大鼠穿越平台次数减少(P<0.05)；与T2DM组相比，3个PTE剂量组大鼠穿越平台次数增多(P<0.05)。

表1 各组大鼠学习记忆能力比较(n=10)

2.2 各组大鼠海马组织形态的比较见图1。由图1可知，与正常对照组相比，T2DM组大鼠海马组织神经元细胞排列紊乱，细胞间隙变大，部分细胞破裂。与T2DM组相比，3个PTE剂量组大鼠海马神经元排列较紧密，细胞间隙变小，神经元损伤有所改善。

A：正常对照组；B：T2DM组；C：PTE低剂量组；D：PTE中剂量组；E：PTE高剂量组

2.3 各组大鼠海马组织中Aβ1-40、Aβ1-42水平的比较见表2。由表2可知，与正常对照组相比，T2DM组大鼠海马组织中Aβ1-40、Aβ1-42水平升高(P<0.05)。与T2DM组相比，PTE中、高剂量组大鼠海马组织中Aβ1-40、Aβ1-42水平降低(P<0.05)。

表2 各组大鼠海马组织中Aβ1-40、Aβ1-42水平比较(n=10) μg/L

2.4 各组大鼠海马组织中IL-1β、IL-6、TNF-α水平的比较见表3。由表3可知，与正常对照组相比，T2DM组大鼠海马组织中IL-1β、IL-6、TNF-α水平升高(P<0.05)。与T2DM组相比，PTE中、高剂量组大鼠海马组织中IL-1β、IL-6和TNF-α水平降低(P<0.05)。

2.5 各组大鼠海马组织中PI3K/AKT信号通路相关蛋白表达水平的比较见图2和表4。与正常对照组相比，T2DM组大鼠海马组织中PI3K、p-AKT/AKT、Bcl-2蛋白表达水平降低(P<0.05)，Bax、Caspase-3蛋白表达水平升高(P<0.05)。与T2DM组相比，3个PTE剂量组PI3K、Bcl-2蛋白表达水平以及PTE低、高剂量组p-AKT/AKT蛋白表达水平升高(P<0.05)，3个PTE剂量组Bax、Caspase-3蛋白表达水平降低(P<0.05)。

1：正常对照组；2：T2DM组；3：PTE低剂量组；4：PTE中剂量组；5：PTE高剂量组

表4 各组大鼠海马组织中PI3K/AKT信号通路相关蛋白表达水平(n=3)

3 讨论

本研究结果显示，与正常对照组相比，T2DM组大鼠表现出明显的认知功能障碍，海马组织中PI3K/AKT信号通路受到抑制，Aβ、促炎因子以及凋亡蛋白水平增加。PTE干预后，各剂量组大鼠认知功能均有所改善，海马组织中PI3K/AKT信号通路被激活，Aβ、促炎因子以及凋亡蛋白水平有所降低。

PI3K/AKT是体内重要的胰岛素信号通路，对体内葡萄糖转运、细胞增殖与凋亡有着重要的调节作用[11]。有研究[12]表明在糖尿病大鼠中PI3K/AKT信号通路处于抑制状态，这与我们的研究结果相一致：T2DM组大鼠海马组织中PI3K、p-AKT/AKT蛋白表达水平降低。PTE干预后，PI3K、p-AKT/AKT蛋白表达水平增加，表明PTE可以上调PI3K的表达，促进AKT的磷酸化，对PI3K/AKT信号通路具有激活作用。PI3K/AKT信号通路的激活不仅会影响血糖水平以及胰岛素水平，而且对下游相关凋亡蛋白的表达具有调节作用[13]。磷酸化的AKT能够调节Bcl-2家族成员的活性，磷酸化Bax蛋白，阻止Bax与Bcl-2的结合，进而抑制Capase-3蛋白的活化，抑制细胞凋亡。本研究结果显示，PTE干预后，海马组织中Bcl-2蛋白表达水平增加，Bax、Caspase-3蛋白表达水平降低，表明PTE可以增强海马组织抗凋亡能力，抑制海马细胞凋亡。

Aβ聚集形成的老年斑是认知功能障碍的主要病理改变[14]。淀粉样前体蛋白被β分泌酶和γ分泌酶切割后会产生具有神经毒性的Aβ，其中Aβ1-40是含量最多的亚型，Aβ1-42是毒性作用最强的亚型[15]。葡萄糖稳态失调、胰岛素抵抗、胰岛素信号传导受损等会促进Aβ水平增加[16]。在T2DM组中，两种亚型水平均较高，PTE干预后，低、中、高剂量组海马组织中Aβ1-40水平均下降，中、高剂量组Aβ1-42水平下降，表明PTE可以降低海马组织中Aβ水平。研究[17]表明，激活PI3K/AKT信号通路，可抑制GSK-3β的活性，从而影响Aβ产生。本研究结果提示PTE可能通过激活PI3K/AKT信号通路，减少Aβ的产生。

神经炎症是认知功能障碍的重要原因。糖尿病患者长期处于慢性高血糖状态，高血糖可激活NF-κB信号通路，促进胶质细胞分泌各种促炎因子，例如IL-6、TNF-α和IL-1β[18]。降低炎症状态对于改善认知功能有一定的作用。本研究结果显示T2DM组大鼠炎症因子水平较高；PTE干预后，促炎因子水平降低，表明PTE可以减轻糖尿病大鼠炎症反应。研究[19]发现，激活PI3K/AKT/Nrf2信号通路，可抑制炎症反应。本研究结果提示，PTE可能通过促进AKT的磷酸化，影响促炎因子的生成，从而发挥抗炎效果。

综上所述，PTE对T2DM大鼠认知功能障碍具有改善作用，其机制可能与激活PI3K/AKT信号通路、降低Aβ水平、抑制炎症反应和细胞凋亡有关。