陈晓婷，关 宏，朱金峰，马淑丽，刘振艳，杨文钦，刘吉成

（齐齐哈尔医学院，黑龙江齐齐哈尔 161006）

中药药酒历史悠久。中草药能够强身健体，且毒副作用小，与酒相溶，酒助药行，相得益彰，药酒已成为保健常用的饮品[1-2]。中药黄芪具有很高的药用价值和经济价值，素以“补气诸药之最”著称，是最常用的中药材，已有2 000多年的药用历史，中医认为黄芪具有补气健脾、利水消肿、固表止汗和托疮生肌等功效[3-10]。黄芪属于多年生药材，而黄芪的地上部分（茎秆，叶、花和果）每年均可采收，且产量是地下部分（根）的几倍至十几倍，却长期被弃之为废，没有被充分利用。根据相关文献分析，地下及地上部分均含有多糖、皂苷、黄酮等有效成分，且活性成分种类一致、仅在量上略有差异。研究还显示黄芪地上部分总皂苷、总黄酮含量较高[11-15]。2019年，黑龙江省出台了与干制黄芪茎叶和干制黄芪花相关的食品安全地方标准，充分证明黄芪地上部分也可作为食品原料进行开发 利用[16-17]。

目前，药酒常用的制备方法有浸提法、渗漉法、超声提取法、回流提取法、煎煮法和超滤法等[18-21]， 其中浸提法最为常用。动态逆流提取工艺是将两个以上的动态提取罐机组串联，提取溶媒沿着罐组内各罐药料的溶质浓度梯度逆向地由低向高顺次输送通过各罐，并与药料保持一定提取时间并多次套 用[22-27]。此技术主要利用了固液两相中有效成分的浓度梯度差，逐级将药材中有效成分扩散至起始浓度较低的提取溶剂中，达到最大限度转移药材中有效成分的目的。与传统药酒浸提的制备方法相比，逆流提取具有提取效率高、提取溶剂少的优势，连续动态化的提取能适用于工业化的生产。

为此，本研究利用罐组式动态逆流提取工艺和传统醇浸提法，以黄芪地上部分为原料，对黄芪地上部分提取液进行研究。通过对比黄芪提取液的有效成分总糖、总皂苷和总黄酮的提取率，确定最佳提取工艺。本研究首次将逆流提取方法应用在黄芪地上部分浸提酒的研制，在开发新型功能性食品领域有较好前景。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

干黄芪茎叶，黑龙江省齐齐哈尔市富裕县；95%食用酒精，大庆博润生物科技有限公司；香草醛、冰醋酸、高氯酸和浓硫酸（均为分析纯），科密欧化学试剂；苯酚（分析纯），上海生工生物工程有限公司；葡萄糖（优级纯），Acros；黄芪甲苷（纯度＞98%）、毛蕊异黄酮（纯度＞98%），成都普菲德生物技术有限公司；甲醇（色谱纯，迪马科技）。

1.2 仪器与设备

可见分光光度计，上海精科仪器有限公司；UV2550-紫外可见分光光度计，日本岛津公司；SHZ-D循环水式真空泵，石家庄阳星仪器贸易有限公司；MS105DU电子天平，梅特勒-托利多国际贸易有限公司；FA1604电子天平，上海精科仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 黄芪浸提酒中总糖的测定

（1）葡萄糖标准曲线的制备。精密称取干燥的葡萄糖对照品0.106 0 g，加水制成含葡萄糖0.106 mg/mL的标准使用液。分别吸取使用液0 mL、0.1 mL、 0.2 mL、0.4 mL、0.8 mL和1.2 mL，用蒸馏水定容至 2 mL，得到质量分别为0 mg、0.010 6 mg、0.021 2 mg、 0.042 4 mg、0.084 8 mg和0.127 2 mg的标准系列，以相应试剂为空白，按照可见分光光度法，在波长490 nm处测定吸光度值[28]。以OD490nm为纵坐标，葡萄糖质量（mg）为横坐标，绘制标准曲线，得到葡萄糖回归方程Y=5.607 1X+0.020 1（相关系数

R2=0.999 8）。

（2）供试品（黄芪浸提酒）总糖的测定。精密量取供试品溶液2 mL置于25 mL具塞试管中，加入5%苯酚溶液2 mL，混匀。加入10 mL浓硫酸，混匀，沸水浴中煮沸15 min，冷却后，在可见分光光度计上测定，将测定结果代入标准曲线回归方程，计算，即得总糖质量。

提取率计算公式为：

1.3.2 黄芪浸提酒中总皂苷的测定

（1）黄芪甲苷标准曲线制备。精密称取黄芪甲苷5.40 mg，用甲醇制成含黄芪甲苷浓度为0.54 mg/mL的标准使用液，分别吸取标准使用液0.1 mL、0.2 mL、 0.3 mL、0.4 mL和0.5 mL加入10 mL容量瓶，得到质量分别为0 mg、0.054 0 mg、0.108 0 mg、0.162 0 mg、 0.216 0 mg和0.270 0 mg的标准系列，以相应试剂为空白，按照可见分光光度法，在波长540 nm处测定吸光度值[29]。以OD540nm为纵坐标，黄芪甲苷质量（mg）为横坐标，绘制标准曲线，得到黄芪甲苷回归方程Y=1.751 9X+0.020 8（相关系数R2=0.996 3）。

（2）供试品（黄芪浸提酒）总皂苷的测定。精密量取供试品溶液0.5 mL置于10 mL具塞试管中，90 ℃水浴至挥干溶剂，加入0.4 mL 5%的香草醛冰醋酸溶液，再加入1.6 mL高氯酸混匀，100 ℃水浴2 min，冷却5 min,加入冰醋酸8 mL，摇匀，在可见分光光度计上测定，将测定结果代入标准曲线回归方程，计算，即得总皂苷质量。

提取率计算公式为：

1.3.3 黄芪浸提酒中总黄酮的测定

（1）毛蕊异黄酮标准曲线制备。精密称取毛蕊异黄酮3.40 mg，用甲醇制成含毛蕊异黄酮0.34 mg/mL的标准使用液，分别吸取使用液0 mL、0.10 mL、 0.15 mL、0.20 mL、0.25 mL和0.30 mL用甲醇定容至10 mL，得到质量分别为0 mg、0.034 0 mg、0.051 0 mg、 0.068 0 mg、0.085 0 mg和0.102 0 mg的标准系列，以相应试剂为空白，按照紫外-可见分光光度法，在波长265 nm处测定吸光度值[30]。以OD265nm为纵坐标，毛蕊异黄酮（mg）为横坐标，绘制标准曲线，得到毛蕊异黄酮回归方程Y=7.388 2X+0.022 8（相关系数R2=0.998 0）。

（2）供试品（黄芪浸提酒）总黄酮的测定。直接将供试品加入比色皿在紫外可见分光光度计上测定，将测定结果代入标准曲线回归方程计算，即得总黄酮质量。

提取率计算公式为：

1.3.4 醇提法单因素试验

根据常用浸提酒浓度选择考察的酒精浓度为40%、50%、60%，单次提取时间分别考察了3 h、4 h、5 h，提取次数分别考察了3次、4次、5次，通过总糖、总皂苷、总黄酮的提取率进行分析确定醇浸提法单因素最佳提取条件。

1.3.5 罐组式逆流提取方法

罐组式逆流提取示意图见图1。

图1 罐组式逆流提取示意图

将干黄芪茎叶剪成1 cm长的小段，取4个6 L不锈钢桶，分别标识A桶、B桶、C桶和D桶，分别向4个不锈钢桶中添加100 g干黄芪茎叶。如图1所示，向A桶添加40%食用酒精4 L，浸泡2 h后，提取4 h，采用真空抽滤方式过滤，收集清液，标记为A1。向A桶第2次添加40%食用酒精4 L，浸泡4 h后，采用真空抽滤方式过滤，收集清液，标记为A2；向B桶添加A桶第2次收集的清液A2，浸泡 6 h后，采用真空抽滤方式过滤，收集清液，标记为B1。向A桶第3次添加40%食用酒精4 L，浸泡4 h后，采用真空抽滤方式过滤，收集清液，标记为A3；再向B桶添加A桶第3次收集的清液A3，浸泡4 h后，采用真空抽滤方式过滤，收集清液，标记为B2；向C桶添加B桶第2次收集的清液B2，浸泡6 h后，采用真空抽滤方式过滤，收集清液，标记为C1。 A桶第4次添加40%食用酒精4 L，浸泡4 h后，采用真空抽滤方式过滤，收集清液，标记为A4；向 B桶添加A桶第4次收集的清液A4，浸泡4 h后，采用真空抽滤方式过滤，收集清液，标记为B3；向C桶添加B桶第3次收集的清液B3，浸泡4 h后，采用真空抽滤方式过滤，收集清液，标记为C2；向D桶添加C桶第2次收集的清液C2，浸泡6 h后，采用真空抽滤方式过滤，收集清液，标记为D1，测定D1收集液。

1.3.6 统计学分析

采用SPSS 23.0软件进行统计分析，运用两个独立样本t检验比较逆流提取法与醇浸提法对总糖、总皂苷、总黄酮提取率的差异，检验水准α=0.05，P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果与分析

2.1 黄芪浸提酒的单因素优化结果

2.1.1 不同酒精浓度对黄芪浸提酒中总糖、总皂苷、总黄酮提取率的影响

分别使用40%、50%、60%食用酒精4 L提取100 g干燥黄芪茎叶，由图2可知，在酒精度为40%时，总糖、总皂苷、总黄酮提取率均为最高。

图2 酒精度对黄芪浸提酒中总糖、总皂苷、总黄酮提取率的影响

2.1.2 不同提取时间对黄芪浸提酒中总糖、总皂苷、总黄酮提取率的影响

在40%的酒精浓度下，考察不同提取时间对提取率的影响，由图3可知，随着提取时间的延长，提取率也随之增加，但提取时间对提取率影响较小，提取时间为5 h时总黄酮的提取率最大，总糖和总皂苷在提取时间为4 h和5 h没有变化，综合时效考虑，选择单次的提取时间为4 h。

图3 提取时间对黄芪浸提酒中总糖、总皂苷、总黄酮提取率的影响

2.1.3 提取次数对黄芪浸提酒中总糖、总皂苷、总黄酮提取率的影响

分别考察提取3次混合液、4次混合液、5次混合液对提取率的影响，由图4可知，总皂苷和总黄酮在提取4次时提取率最高，确定了提取次数为 4次。

图4 提取次数对黄芪浸提酒中总糖、总皂苷、总黄酮提取率的影响

2.2 逆流提取法与醇浸提法提取率显著性分析结果

通过2.1单因素优化的浸提条件，在相同条件下，对逆流提取4次混合液进行4次重复实验，醇提取混合液进行2次重复实验，并对两种提取方法的总糖、总皂苷、总黄酮的提取率进行了比较分析。采用两个独立样本t检验比较逆流提取法与醇浸提法提取率的差异。由表1可知，两种方法中总多糖的提取率差异无统计学意义（t=1.56，P=0.194 5）；总皂苷和总黄酮提取率差异具有统计学意义（t=16.24，P＜0.000 1；t=4.80，P=0.008 7），逆流提取法对总皂苷和总黄酮的提取率优于醇浸提法。

表1 逆流提取法与醇浸提法对总糖、总皂苷和总黄酮提取率的结果

3 结论

本文建立了以黄芪地上部分为原料的浸提酒的逆流提取方法，对比分析了醇提取法和逆流提取法中总糖、总皂苷、总黄酮提取率的差异。结果表明，同样提取条件下，逆流提取的有效成分总皂苷和总多糖提取率优于普通醇浸提法。该方法首次将逆流提取方法应用在黄芪地上部分浸提酒中，具有提取效率高、节省溶剂的优点，连续动态化的提取，同时能适用于工业化的生产，在开发新型功能性食品领域有较好前景。