付燕秋，吕志敏，王 智，于 佳

（青岛市产品质量检验研究院，青岛市产品质量检验技术研究所，山东青岛 266000）

啤酒被认为是一种微生物安全性较高的饮料，因其含有许多内在的抗菌因素，包括酒精（2.5%vol～ 5.0%vol）、啤酒花苦味酸（约为17～55 IBU）、低pH（3.9～4.4）、高浓度二氧化碳（约为0.5%）、低溶氧量（＜0.1 mg/L）和缺乏营养物质[1]。此外，啤酒生产加工过程，如糖化、麦芽汁煮沸、巴氏杀菌、无菌过滤和冷藏等对维持微生物稳定性起到保护作用[1]。2012年，中华人民共和国卫生部发布《食品安全国家标准 发酵酒及其配制酒》（GB 2758—2012），取消了啤酒菌落总数和大肠菌群的检测，仅需检测金黄色葡萄球菌和沙门氏菌。笔者从2019年负责成品啤酒微生物检测以来，共检测1 000余批次样品，均未检出两种致病菌。这与一些研究结果一致，在啤酒中食品致病菌的存活率通常很低[2-5]。但HOMPESCH[6]的研究表明，沙门氏菌可在啤酒中存活长达63 d。L'ANTHOËN等[7]报告部分食品致病菌可在无酒精啤酒中生长。高松[8]的卫生监督监测报告结果显示，162批次市售啤酒，共检出致病菌3株，检出率为1.85%。本文通过在啤酒中接种等量的金黄色葡萄球菌和沙门氏菌，在不同的抑菌条件下，静态培养，研究其生长情况，以期为今后啤酒的微生物检测工作提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料

菌种：金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus） ATCC6538；鼠伤寒沙门氏菌（Salmonella typhimurium）ATCC14028。培养基：7.5%NaCl肉汤、缓冲蛋白胨水（Buffered Peptone Water，BPW）、Baird-Parker琼脂、XLD琼脂和营养琼脂，北京陆桥技术股份有限公司。

1.2 仪器与设备

BSC-1304ⅡA2生物安全柜，苏州安泰空气技术有限公司；SHH-150L生化培养箱，重庆四达实验仪器有限公司；2RH-250生化培养箱，上海一恒科学仪器有限公司；SPX-250BSH-Ⅱ生化培养箱，上海新苗医疗器械制造有限公司；FE20梅特勒酸度计，梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；DensiCHEK plus比浊仪，BioMerieux。

1.3 实验方法

1.3.1 微生物接种物制备

金黄色葡萄球菌和沙门氏菌菌株分别接种到营养琼脂平板上活化培养。24 h后，挑取单一菌落用无菌生理盐水通过比浊仪，配制比浊度为0.5的菌悬液，再用无菌生理盐水稀释目标接种物约为 105CFU/mL，备用。金黄色葡萄球菌目标接种物标记为J菌液；沙门氏菌目标接种物标记为S菌液。

1.3.2 实验用啤酒准备

啤酒根据酒精含量分为无酒精（＜0.5%vol）、中酒精度（2.5%vol～3.6%vol）和高酒精度（≥4.0%vol） 啤酒。实验用啤酒均为实验室检验剩余样品，具体见表1。

表1 实验用啤酒

1.3.3 金黄色葡萄球菌在啤酒中的存活

将表1中的B1、B2、B3、B4和B5用无菌量筒各取250 mL置于无菌均质袋中，一式两份。一份取 0.5 mL J菌液加入各均质袋，标记为Pn；另一份，不加菌液，作为阴性对照，标记为CK-。同时，再取 0.5 mL J菌液加入250 mL 7.5% NaCl肉汤中，作为阳性对照，标记为CK+。从Pn、CK-和CK+各均质袋中吸取1 mL，选择适宜的稀释度，涂布BP平板，36 ℃培养48 h后，计数。将Pn、CK-和CK+各均质袋，置于25 ℃，静态培养，每天同一时间 计数。

1.3.4 沙门氏菌在啤酒中的存活

实验操作同1.3.3。其中，J菌液换为S菌液；阳性对照培养基为250 mL缓冲蛋白胨水（BPW）；计数方法为20 mL冷却至46 ℃的XLD琼脂培养基倾注平板，36 ℃培养24 h后，计数。

1.3.5 在无酒精啤酒中储存温度和pH值对沙门氏菌存活的影响

啤酒标签上标识贮存条件为5～25 ℃[9]。将接种S菌液的无酒精啤酒在5 ℃、15 ℃和25 ℃下，静态培养，评估储存温度对沙门氏菌存活的影响。本文测得实验用无酒精啤酒pH值为4.19，在啤酒的典型pH值范围内[10]。沙门氏菌最适生长pH值为6.8～7.8[11]。用无菌过滤的HCl或NaOH调节pH值，15 ℃静态培养，评估pH值为4.0、4.2、4.5和7.0时对沙门氏菌存活的影响。

2 结果与分析

2.1 金黄色葡萄球菌和沙门氏菌在啤酒中的存活情况

金黄色葡萄球菌在P1、P2、P3、P4和P5中的生存情况如图1所示。25℃时，在P1、P2、P3、P4和P5中只存活了3～5 d，即使在无酒精啤酒P1中也不能存活，说明其在不同酒精度啤酒中均无法启动生长。MENZ等[2]报道，麦芽汁中低水平的啤酒花苦味酸可以抑制革兰氏阳性菌生长。图1进一步佐证了这种保护作用，即使低水平的啤酒花苦味酸也会抑制金黄色葡萄球菌的生长并限制其存活。

图1 酒精度对金黄色葡萄球菌在啤酒中存活的影响

沙门氏菌在P1、P2、P3、P4和P5中的生存情况如图2所示。25 ℃时，在P2、P3、P4和P5中6～9 d 失去活性，而在无酒精啤酒P1中1 d后迅速生长。说明沙门氏菌在中、高酒精度啤酒中无法启动生长，但能在无酒精啤酒中剧烈生长，这与L’ANTHOËN等[7]的研究一致。

图2 酒精度对沙门氏菌在啤酒中存活的影响

2.2 在无酒精啤酒中储存温度和pH值对沙门氏菌存活的影响

储存温度对无酒精啤酒中沙门氏菌存活的影响如图3所示。沙门氏菌在25 ℃时的生长速度明显快于15 ℃ 时，而在5 ℃时则无明显增殖现象。25 ℃时，沙门氏菌在5 d内从1.1×105CFU/mL到8.8×107CFU/mL， 达到最大菌群数。15 ℃时，有一个较长的滞后阶段，14 d开始生长，且整个生长趋势缓慢。5 ℃时，沙门氏菌未生长，也未在35 d后完全失活。

图3 储存温度对沙门氏菌在无酒精啤酒中存活的影响

无酒精啤酒的pH值对沙门氏菌存活的影响如图4所示。当无酒精啤酒pH值增加时，沙门氏菌生长得到增强，生长滞后阶段变短。pH为4.2时，沙门氏菌14 d开始生长；pH为4.5时，13 d开始生长；pH为7.0时，仅1 d就开始剧烈生长。而pH为4.0时，其从10 d开始活性显著下降，25 d后被灭活。由此可知，pH值是啤酒对沙门氏菌产生抑制作用的一个重要因素，将无酒精啤酒的pH值从初始的4.2增加至4.5和7.0导致繁殖速度加快和滞后阶段减短，而pH值降低至4.0会使其失活。通常啤酒的pH值为3.9～4.4[7]。综上所述，沙门氏菌在啤酒中难以生存。

图4 pH值对沙门氏菌在无酒精啤酒中存活的影响

3 结论

本文研究了啤酒中两种致病菌的生长和存活情况。在中、高酒精度啤酒中，两种致病菌均无法生长存活。在无酒精啤酒中，金黄色葡萄球菌失活，这是由于啤酒花苦味酸的存在；沙门氏菌能迅速生长，但降低啤酒pH值生长被抑制。由此可见，国家标准强制要求检验的两种致病菌在啤酒中存在的可能性较低，尤其在中、高酒精度啤酒中几乎没有致病菌传播的风险。但由于沙门氏菌在低温下灭活速度减慢，在低温保存的鲜啤酒中存在被检出的风险。此外，由于无酒精（＜0.5%vol）条件可以支持沙门氏菌的生长（特别是在pH值略高的情况下），因此对未经巴氏杀菌的无酒精啤酒产品，检验人员应在工作中加强对其的重视。