杨凯,魏雨辰,吴望军,钮莹芳,邱启勇,邵勇钢,翟曼君,董新星,韦伟,陈杰,张立凡*

(1.南京农业大学动物科技学院,江苏 南京 210095;2.新疆农业大学动物科学学院,新疆 乌鲁木齐 830052; 3.云南农业大学动物科学技术学院,云南 昆明 650201)

诱导细胞死亡DNA片段化因子α样效应因子A(cell death-inducing DNA fragmentation factor α-like effector A,CIDEA)基因是一类诱导细胞凋亡的因子,它也具有调控脂质代谢的作用[1]。以往的研究显示CIDEA在小鼠棕色脂肪组织中高表达,敲除CIDEA后小鼠的产热和脂肪分解增多,机体变瘦,其原因是CIDEA能够通过抑制解偶联蛋白1(UCP1)的活性来调节棕色脂肪组织中的脂质代谢,因此CIDEA基因也被认为是棕色脂肪的标志基因之一[2-3]。而与人相关的研究则表明CIDEA主要存在于白色脂肪组织中,其主要作用是促进脂滴形成和调节肥胖者的胰岛素抵抗[4-6]。目前,从对猪的相关研究中也发现,CIDEA基因在白色脂肪组织中高表达,肥胖型猪脂肪组织的CIDEA基因表达量要显著高于瘦肉型猪[7-8],说明CIDEA基因在猪的脂质沉积中也可能发挥着重要作用。

作为猪脂肪组织的一种,肌内脂肪(IMF)位于肌肉纤维周围及筋膜内部,主要以大理石花纹在肌肉中呈现[9]。由于肌内脂肪含量的高低与猪肉品质呈正相关[10],对其形成机制的解析一直以来都是猪育种学家的核心研究内容之一。进入21世纪后,与猪肌内脂肪沉积相关的基因和标记不断被发现,例如脂肪酸结合蛋白基因(FABP)[11-12]和链酰基辅酶A脱氢酶基因(ACADM)[13],这些基因可以为猪肌内脂肪性状的标记辅助选择提供可用的基础资源,进而为加快猪肉品质的遗传改良提供新途径。CIDEA基因作为可能影响猪脂肪沉积的重要候选基因,而且最近的转录组研究也显示CIDEA可以作为影响猪肌内脂肪含量的潜在基因[14],关于其如何影响猪的肌内脂肪沉积我们却知之甚少。因此,本研究拟通过分析猪CIDEA基因上游调控区的突变与其mRNA表达水平、转录活性以及猪肌内脂肪含量之间的相关性,来获取CIDEA基因的变异与猪肌内脂肪沉积之间的关联,为进一步揭示CIDEA基因对猪肌内脂肪的调控途径,以及后续应用CIDEA基因标记对猪肌内脂肪性状进行分子改良提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 试验动物

试验动物来自常州市康乐农牧有限公司的杜洛克×长白×大白三元杂交猪群体(n=263)。肌内脂肪含量的测定采用索氏抽提法,参考《食品安全国家标准 食品中脂肪的测定:GB 5009.6—2016》,使用乙醚抽提单块肌肉样品中的肌内脂肪。在胴体重近似的个体中选取肌内脂肪含量高、低组各26个个体,其中高组的肌内脂肪含量为(4.358±0.225)%,低组的肌内脂肪含量则为(2.259±0.088)%。

1.2 总RNA提取与实时荧光定量PCR(qPCR)

取个体的背最长肌组织置于2 mL离心管内,使用Trizol提取试剂盒(艾科瑞生物,湖南)提取组织的总RNA,之后用5×PrimeScriptTMRT Master Mix试剂盒(TaKaRa,大连)进行反转录。根据GenBank数据库中收录的CIDEA、FABP4和FABP3的mRNA序列,使用Primer 5.0软件设计引物(表1)。qPCR使用Hieff®qPCR SYBR Green Master Mix试剂盒(翊圣生物,上海),在StepOne Plus qPCR仪(ABI,美国)上进行试验。采用20 μL反应体系:SYBR Green Master Mix 10 μL,上、下游引物各0.4 μL,灭菌的DEPC水 7.2 μL,cDNA模板 2 μL。反应条件:95 ℃预变性5 min;95 ℃变性10 s,60 ℃退火30 s,72 ℃延伸15 s,40个循环。每个样本重复3次,以酸性核糖体磷蛋白大亚基(ribosomal protein lateral stalk subunit P0,RPLP0)基因为内参基因,采用2-ΔΔCT法计算基因的相对表达量。

表1 实时荧光定量PCR(qPCR)及CIDEA调控区扩增引物Table 1 Primer sequences for real-time quantitative PCR(qPCR)and the regulation region of CIDEA

1.3 DNA提取与PCR扩增

剪出黄豆粒大小的背最长肌组织样置于2 mL离心管中,用经典的酚氯仿抽提法提取组织的DNA。根据GenBank数据库中收录的猪CIDEA序列(NC_010448.4),找到上游调控区2 kb片段,使用Primer Premier 5.0软件分段设计引物(表1)。之后对CIDEA上游调控区2 kb片段进行扩增,将扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳试验,符合目的片段长度且丰度高的单个条带样品送至生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序。

1.4 序列比对及连锁不平衡分析

测序得到的文件用DNAstar 7.1软件进行查看和比对,统计每个个体的基因型信息。多个位点间的连锁不平衡使用HaploView 4.2软件进行分析。

1.5 构建荧光素酶报告载体

在猪CIDEA基因g.97268816 T>A位点前后各250 bp设计引物,将PGL3-basic作为报告载体,根据PGL3-basic载体上的多克隆酶切位点信息,分别在引物上、下游5′端加上KpnⅠ和Hind Ⅲ 2个限制性内切酶的酶切位点。挑选不同基因型个体的DNA作为模板,使用T3酶扩增目的片段,胶回收扩增产物并与PGL3-basic载体通过KpnⅠ和Hind Ⅲ进行双酶切,用T4连接酶对酶切产物连接,然后将目的产物转化DH5α感受态细胞,置于37 ℃摇床上培养,待长出单克隆菌落后挑取单个菌落,测序确认。

1.6 细胞培养、转染及双荧光素酶报告基因活性检测

参考尹杭等[15]的方法,首先将实验室保存的HEK 293T细胞系(翼飞雪生物,南京)置于37 ℃水浴中复苏,离心后弃冻存液,然后加入DMEM高糖培养基,轻轻吹打使细胞悬浮,最后将其接种到T25细胞培养瓶中,置于含5% CO2的37 ℃培养箱中培养12～16 h。待细胞融合度达到80%以上时,加入胰蛋白酶使细胞充分消化,约2 min后,加入等量DMEM高糖培养基终止消化,然后将细胞全部转移至15 mL离心管,1 000 r·min-1离心5 min,弃上清液后加入DMEM高糖培养基,吹打均匀,均匀接种至12孔细胞培养板。待细胞量长满约80%时,将g.97268816 T>A位点的TT型、AA型和PGL3-basic空载等3种双荧光素酶报告载体,分别与内参质粒海肾荧光素酶报告载体(pRL-TK)用Lipofectamine 3000(Invitrogen,上海)转染试剂瞬时转染293T细胞系,24 h后用裂解液收集细胞,混和均匀后加至1.5 mL离心管,10 000 r·min-1离心1 min,取上清液,用双荧光素酶报告基因检测试剂盒(Promega,美国)和酶标仪(Bio-Tek,美国)检测荧火虫荧光素酶活性,用pRL-TK质粒产生的海肾荧光素酶活性进行矫正,计算双荧光素酶报告载体的启动子区活性值。

1.7 统计分析

运用SPSS 25.0软件对CIDEA基因突变与肌内脂肪含量之间的关联进行分析。线性模型如下:Yijk=μ+Wi+Gj+Sk+eijk。其中,Yijk为肌内脂肪含量表型值;μ为总体平均数;Wi为胴体重,设为协变量;Gj为基因型效应,Sk为性别,Gj和Sk设为固定效应;eijk为残差效应。使用Bonferroni多重比较法对不同基因型间的差异进行比较。此外,使用配对t检验分析2组之间的差异,用单因素方差分析法分析不同基因型个体的mRNA表达水平差异。

2 结果与分析

2.1 CIDEA基因的表达及上游调控区的变异分析

如图1-A所示:本试验构建的肌内脂肪高低组群体之间的肌内脂肪含量差异极显著(P<0.01),qPCR检测发现CIDEA基因在猪肌内脂肪含量高、低组群体中的mRNA表达水平也差异极显著(P<0.01)(图1-B)。利用DNAstar 7.1软件对CIDEA基因上游调控区约2 kb的序列测序后进行比对,结果显示在肌内脂肪高、低组群体中共存在6个SNP位点(图1-C),这些位点在肌内脂肪含量高低组的基因频率均差异极显著(P<0.01)(表2)。鉴于标签SNP是通过连锁不平衡确定的少数能够代表感兴趣基因组区域内的所有SNP,并且彼此之间尽可能相互独立的SNP位点[16],因此对上述6个SNP位点做连锁不平衡分析,发现g.97268816 T>A和g.97269217 G>A之间,以及它们与其他位点之间处于连锁平衡状态,而g.97269280 A>G、g.97269353 C>T、g.97269420 T>C和g.97269575 G>A这4个位点相互之间处于连锁不平衡状态(图1-D)。因此,本研究选取了g.97268816 T>A、g.97269217 G>A和g.97269353 C>T 3个标签SNP位点进行后续的分析。

图1 CIDEA的表达及上游调控区变异分析Fig.1 CIDEA expression and variation analysis of its upstream regulatory region 1)A. 肌内脂肪含量高(HG)、低(LG)组群体;B. CIDEA基因在肌内脂肪含量高组和低组中的表达差异;C. 6个突变位点杂合子的测序图谱(框内为SNP位点位置);D. CIDEA基因突变位点的连锁不平衡分析(以R2值来代表2个位点间的连锁不平衡程度)。2)组间不同大写字母表示差异极显著(P<0.01)。1)A. Intramuscular fat contents in high(HG)and low(LG)groups;B. The difference expression of CIDEA gene in high and low intramuscular fat content groups;C. Sequence map of heterozygotes at six mutation loci(SNP locus was in box);D. Linkage disequilibrium analysis of CIDEA gene mutations(The R2 value represents the degree of linkage disequilibrium between these loci). 2)The different capital letters between groups indicate highly significant difference(P<0.01).

表2 CIDEA基因SNP位点在肌内脂肪含量高、低组中的基因频率Table 2 The allele frequency of SNP loci in CIDEA gene between high and low intramuscular fat content groups

2.2 g.97268816 T>A、g.97269217 G>A和g.97269353 C>T位点与猪肌内脂肪含量的关联分析

进一步在杂交猪群体中扩大样本量对g.97268816 T>A、g.97269217 G>A和g.97269353 C>T这3个SNP位点与肌内脂肪含量的关系进行关联分析,发现g.97268816 T>A位点不同基因型个体的肌内脂肪含量之间存在显著差异,其中AA基因型个体的肌内脂肪含量显著高于TT基因型个体(P<0.05),而TA基因型个体较TT基因型个体的肌内脂肪含量高0.37,但两者之间没有达到显著差异。g.97269217 G>A和g.97269353 C>T位点中不同基因型个体的肌内脂肪含量差异均不显著(P>0.05)(表3)。

表3 g.97268816 T>A、g.97269217 G>A和g.97269353 C>T位点与猪肌内脂肪含量的关联分析Table 3 Association analysis of g.97268816 T>A,g.97269217 G>A and g.97269353 C>T loci with intramuscular fat(IMF)contents of pigs

2.3 CIDEA基因和肌内脂肪标记基因在g.97268816 T>A位点不同基因型个体的表达分析

检测g.97268816 T>A不同基因型个体CIDEA基因mRNA表达,结果(图2)显示:AA基因型个体的表达水平显著高于TT基因型个体(P<0.05),AA基因型FABP4基因表达水平极显著高于TT基因型个体(P<0.01),且显著高于TA基因型个体(P<0.05),不同基因型个体间的FABP3表达水平则未见显著变化(P>0.05)。

图2 CIDEA基因和肌内脂肪标记基因FABP4、FABP3在g.97268816 T>A 位点不同基因型个体中的表达Fig.2 The expression of CIDEA gene and intramuscular fat marker genes FABP4,FABP3 among different genotype individuals at g.97268816 T>A locus 每个群体7个样本。不同大写字母表示差异极显著(P<0.01),不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。下同。Each group contains seven samples. The different capital letters among different genotype groups mean highly significant difference(P<0.01),whereas the different lowercase letters among different genotype groups mean significant difference(P<0.05). The same below.

2.4 CIDEA基因g.97268816 T>A位点不同基因型启动子活性分析

将空载体pGL3-basic和构建好的载体pGL3-T、pGL3-A分别转染293T细胞后,检测荧光素酶活性。结果(图3)发现,与空载相比,pGL3-T和pGL3-A载体的荧光素酶活性均极显著升高(P<0.01),同时pGL3-A载体的荧光素酶活性极显著高于pGL3-T载体(P<0.01),说明AA型CIDEA基因的荧光素酶活性高于TT型,这与AA型猪个体的CIDEA基因表达量和肌内脂肪含量都显著高于TT型个体的结果一致(表3)。

图3 猪CIDEA双荧光素酶报告载体构建(A)及g.97268816 T>A突变不同基因型载体启动子活性分析(B)Fig.3 Construction of dual-luciferase reporter system(A)and analysis of promoter activity of g.97268816 T>A mutant with different genotypes vectors(B)

2.5 CIDEA基因g.97268816 T>A转录因子结合位点预测

运用JASPER在线网站对猪g.97268816 T>A突变位点可能结合的转录因子进行预测,发现位点突变后一共存在22个转录因子,其中有20个为突变后不结合的转录因子,只有2个为突变后新出现的转录因子。评分排名前六的转录因子分别为肿瘤蛋白P73(TP73)、肿瘤蛋白P53(TP53)、E盒锌指蛋白1(ZEB1)、芳基烃受体核传递器样分子(ARNTL)、上游刺激因子1(USF1)和MYC基因相关X因子(MAX)(表4)。

表4 CIDEA基因g.97268816 T>A突变的转录因子结合预测Table 4 Transcription factor binding prediction for g.97268816 T>A mutation of CIDEA gene

3 讨论

作为影响脂肪组织形成和脂肪产热相关的关键基因之一,CIDEA在脂质代谢中发挥着极为重要的作用。研究发现CIDEA可以控制脂滴的融合,对脂肪的储存具有重要的作用[17],而敲除CIDEA会显著提高人脂肪细胞的脂解作用,且CIDEA的表达可以正向调控胰岛素敏感性[6]。这些研究表明CIDEA基因不仅能够促进脂滴融合,也可以改变胰岛素敏感性,进而降低能量消耗,抑制脂肪分解。

CIDEA在脂肪型肉鸡的表达水平显著高于瘦型肉鸡[18],与肌内脂肪性状相关的转录组或单基因的研究发现CIDEA基因的表达与猪、牛和羊等动物中肌内脂肪的沉积呈正相关[13,19],说明CIDEA基因可能影响动物的肌内脂肪沉积。然而,CIDEA基因如何影响猪的肌内脂肪性状至今我们依旧知之有限。本研究在发现CIDEA基因表达水平与猪肌内脂肪含量的高低存在相关的基础上,进一步在CIDEA基因上游调控区发现g.97268816 T>A位点与猪肌内脂肪含量存在显著关联,其AA基因型个体的肌内脂肪含量、CIDEA基因和肌内脂肪沉积标记基因FABP4的表达水平均显著高于TT基因型个体,这些结果暗示CIDEA基因的g.97268816 T>A变异对猪的肌内脂肪沉积存在显著影响,而且其很有可能是通过FABP4基因来实现上述影响的,但对于2个基因之间是否存在相互作用还需要进一步验证。上述结果从不同层面证实了CIDEA基因能够影响猪的肌内脂肪沉积。

我们进一步推测g.97268816 T>A位点突变后造成肌内脂肪含量增加的原因可能是突变后造成其转录活性发生变化,使得CIDEA基因mRNA表达水平提高,增加了肌内脂肪的沉积。本研究验证了g.97268816 T>A位点的突变对转录活性的影响,发现AA型的转录活性极显著高于TT型,说明该位点突变后CIDEA基因的转录活性显著升高,因此我们认为这其中转录因子可能发挥着重要的作用。研究发现CIDEA的转录依赖于PGC1α的激活,同时受到PPAR激动剂的影响[20];小鼠CIDEA基因启动子区存在SREBP1的结合元件,SREBP1的结合会激活CIDEA的转录,而且CIDEA会对SREBP1c的某些靶基因的转录水平产生影响[21],这些结果说明转录因子可以通过结合CIDEA基因的上游调控区来影响其对于脂肪代谢的调控。在本研究中鉴定的g.97268816 T>A突变位点上我们并没有发现其结合元件中存在PGC1α和SREBP1等转录因子,但是突变也造成了多个其他转录因子的结合发生变化,比如与脂肪干细胞凋亡相关的TP53[22],与成脂相关的ZEB1[23],以及调控脂质代谢的USF1[24],提示该位点转录因子的不同结合状态可能造成了CIDEA基因转录活性的升高。

目前对于猪CIDEA基因上游调控区突变位点与脂肪性状关联的研究较少,从本研究的结果可以看出CIDEA基因上游调控区的g.97268816 T>A位点与猪肌内脂肪沉积显著关联,此突变可以正向调控基因的表达,而这一作用可能受到转录因子的调控,这些结果对于后续猪CIDEA的功能研究提供了基础证据,但是其如何通过与转录因子结合来影响猪的肌内脂肪沉积还需要进一步研究。