李 博 李 箐 郭亚娟 潘 硕 吕培军 王 勇

近年来3D 打印技术因其个性化的优点，在构建骨组织缺损修复支架方面逐渐得到关注，其中高分子量的聚己内酯因其具有良好的生物相容性，并且容易打印成形，作为牙槽骨、颌骨缺损修复的3D 打印支架得到广泛应用[1,2]。但是细胞在生长过程中与支架表面贴附，难以模拟体内生长的三维微环境，并且受支架孔隙大小影响，种子细胞在支架表面及内部分布不均匀[3]。

生物3D 打印技术可以将细胞与水凝胶混合，制备“生物墨水”，构建细胞生长的三维微环境，并且利用患者缺损区域的医学影像进行模型构建，可以实现细胞的均匀分布、支架外形的个性化设计，为骨组织缺损修复提供了新的解决思路。生物3D 打印基质材料(明胶、海藻酸钠、胶原、壳聚糖等[4,5,6])已经得到成功应用，然而低浓度海藻酸盐/明胶在提高细胞存活的同时会导致支架机械强度不足，容易解体和破坏。高浓度水凝胶可以改善支架强度，但会抑制细胞存活。因此，设计更好机械强度、保持细胞存活及功能的支架仍然是生物3D 打印的重要挑战。

为了提高骨组织工程支架强度，实现细胞在支架内的三维分布，本研究尝试对细胞共混的生物3D 打印支架进行初步改良，以聚己内酯作为外周支架结构，hASCs 与海藻酸钠/ 明胶水凝胶共混成生物墨水后双喷头共同打印，并将纳米羟基磷灰石加入水凝胶中，研究其对三维支架中细胞增殖及体外成骨向分化的影响，为今后复合支架体内实验奠定基础。

1.材料与方法

1.1 主要仪器及试剂 3D Bioplotter 三维生物打印机(Envision，德国)；hASCs 细胞(Scien Cell，美国，批号11578)；明胶(sigma，美国)；海藻酸钠(sigma)；50nm 羟基磷灰石(sigma)；无水CaCl2(sigma)；CCK-8 试剂盒(dojindo，日本)；钙黄绿素-AM(dojindo)；碘化丙啶(dojindo)；DMEM 培养基(sigma-Aldrich，美国)；聚己内酯(分子量48000～80000)(sigma-Aldrich)；抗坏血酸(sigma-Aldrich)；胎牛血清(Gibco，美国)；0.25%胰蛋白酶(Gibco)；Realtime PCR 试剂盒(KAPA Biosystems，美国)；Trizol RNA 提取试剂盒(Invitrogen，美国)；细胞培养皿(Coming，美国)；孔板(Coming)。

1.2 含hASCs 水凝胶与聚己内酯支架的三维生物打印

1.2.1 hASCs 的培养和传代 将P2 代的hASCs 加入5ml 增殖培养基(Proliferation Medium，PM)中，即低糖DMEM 溶液+10%(体积分数)胎牛血清+1%(体积分数)青链霉素，在5%CO2，37℃的细胞培养孵箱内培养，3d 换液一次。hASCs 达到80～90%汇合时可进行传代，经0.25%胰蛋白酶消化、离心、重悬后，将细胞按照5×104个/ ml密度接种于10cm 培养皿中。如此反复传代3 次后得到P5 代hASCs，作为种子细胞备用。

1.2.2 hASCs 生物墨水的制备 以生理盐水为溶剂，海藻酸钠∶明胶=2∶8(质量比)配制成质量分数10%的溶液，Co60 灭菌备用。取对数期生长的第5 代hASCs，胰蛋白酶消化后离心，加入增殖培养基，移液枪轻吹，配置细胞悬液，计数。按照1×106个/ ml 的细胞浓度，将细胞悬液与海藻酸钠/ 明胶水凝胶混合，装入1 号储料管；将细胞悬液与海藻酸钠/ 明胶水凝胶混合，再加入纳米羟基磷灰石粉末，设置5 个质量分数梯度：0.5%、0.75%、1%、1.25%、1.5%，搅拌均匀，动作尽量轻柔，装入2 号储料管。

1.2.3 聚己内酯高温熔融 将聚己内酯晶体放入高温打印头3 号储料管内，升温至80℃使聚己内酯熔融，备用。

1.2.4 含hASCs 支架三维生物打印 使用2 号管生物墨水直接打印含hASCs 的三维结构体，记为AG 组；将2 号管生物墨水与3 号管熔融PCL进行双喷头打印，记为AGP 组。双喷头打印模型通过直接建模制作。打印环境温度为15℃，打印喷头直径均为300μm，打印过程中设置打印速度范围为5mm/ s～15mm/ s，打印压力范围为0.05～0.4MPa，水凝胶打印温度梯度设置为20℃、22℃、24℃、26℃、28℃，最后根据水凝胶、熔融PCL细丝挤出是否均匀、连续，三维结构体边缘是否完整来确定适宜的打印参数。三维生物打印机根据导入的模型图及打印参数挤出细丝，落入无菌培养皿中，逐层交错叠加成具有三维结构的打印体。每组打印体完成后，均使用100mmol/ L CaCl2溶液交联5min，吸净CaCl2溶液，PBS 冲洗3 次，加入增殖培养基，37℃孵箱培养。

1.3 含hASCs 水凝胶与聚己内酯三维支架的检测

1.3.1 含hASCs 水凝胶与聚己内酯三维支架的力学强度检测 制备15mm×15mm×5mm 大小的AG 水凝胶支架、AGP 支架，每组打印体完成后，均使用100mmol/ L CaCl2溶液交联5 分钟，吸净CaCl2溶液，PBS 冲洗3 次，将两组支架材料放置在材料万能试验机上进行测试。每种材料测试3 个样本，取平均值。

1.3.2 含hASCs 三维支架中细胞增殖情况检测 将AG 组、AGP 组打印体置于增殖培养基中培养，在打印后1d、3d、5d、7d 分别置于24 孔板中对细胞进行CCK-8 检测。记录450nm 各孔光密度值(Optical Density,OD)，绘制增殖曲线。

1.3.3 含hASCs 三维支架中细胞存活情况检测 在打印1 天和7 天后，分别对AG 组、AGP组打印体中hASCs 的细胞存活率进行检测。三维打印体PBS 漂洗3 次，用含有5μmol/ L 钙黄绿素-AM(CAM)和3μmol/ L 碘化丙啶(PI)的生理盐水在37℃，5%二氧化碳的孵箱中孵育45min，PBS 漂洗3 次，用激光共聚焦显微镜分别在488nm(绿光，活细胞)和543nm(红光,死细胞)的波长下观察结构体内细胞活性，对活死细胞进行计数并计算各组三维生物打印体内hASCs 的存活率：细胞存活率=活细胞总数/ (活细胞总数+死细胞总数)×100%。

1.3.4 含hASCs 三维支架中细胞成骨分化检测 使用1 号管中不含纳米羟基磷灰石的生物墨水打印成三维结构体，记为ag 组，作为空白对照。将ag 组、AG 组、AGP 组共三组结构体打印两个批次。三组结构体打印后在基础培养液培养24h，第一个批次在基础培养基中继续培养，第二个批次转入成骨诱导培养基培养(ostegenic medium，OM)，成分为高糖DMEM+10%FBS+10nmol/ L 地塞米松+0.2mmol/ L 抗坏血酸+10mmol/ L β-磷酸甘油+1%青链霉素。两个批次细胞均3 天换液一次。细胞培养2 周后进行RT-PCR 检测，步骤按realtime PCR试剂盒说明书进行，提取细胞总RNA，测试各组打印体细胞中成骨相关基因RUNX2、OCN、OSX 的表达，其中RUNX2、OCN、OSX 引物序列如表。

表1 real-time PCR引物序列

1.4 统计学方法 数据均采用采用SPSS 17.0软件分析。在方差齐性的基础上，应用单因素方差分析对各组打印体内细胞增殖、存活率，成骨相关基因的相对表达量进行总体分析，检测水准为双侧α=0.05。

2.结果

2.1 复合支架打印结果 调试打印机压力、速度、温度等参数后，可打印出具有稳定构象的三维结构体，打印参数如下：水凝胶打印速度8.0mm/ s，打印压力0.25MPa；根据水凝胶挤出形态(图1)，选择打印温度26℃，nHA 质量分数1%；熔融PCL打印速度6mm/ s，打印压力0.12MPa。

图1 不同打印温度及nHA 质量分数时水凝胶形态

2.2 含hASCs 水凝胶与聚己内酯三维支架的力学强度检测 经万能材料试验机测试后，AG 组、AGP 组支架的弹性模量结果分别是1.27±0.17MPa、10.34±0.24MPa(图2)。统计学结果显示AGP 组三维支架与AG 组水凝胶支架在弹性模量的差别上有统计学意义(P＜0.05)。说明将PCL 作为水凝胶的外周支架，有利于提高支架的抗压强度。

图2 两种支架弹性模量测试结果

2.3 含hASCs 三维支架中细胞增殖情况CCK-8 结果显示AG 组、AGP 组在1d、3d、5d、7d 均呈现增殖趋势(图3)，且在7d 时两组支架的OD 值差异无统计学意义(P＞0.05)，表明熔融状态的PCL 与水凝胶共同打印对hASCs 增殖活性无明显影响。

图3 打印后hASCs 增殖曲线

2.4 含hASCs 三维支架中细胞存活情况CAM/ PI 染色结果如图4A,对打印后1 天和7 天各组细胞存活率进行统计学分析，结果显示：打印后1d 时AG 组、AGP 组细胞存活率(图4B)分别为87.64%±0.21%、87.32%±0.45%，差异均无统计学意义(P＞0.05)，打印后7d 时分别为90.53%±0.32%、90.45%±0.29%，差异无统计学意义(P＞0.05)；而AG 组、AGP 组的存活率在7d 时明显高于1d(P＜0.05)。

图4 CAM/ PI 染色及hASCs 存活率

2.5 含hASCs 三维支架中细胞成骨分化检测体外培养14d 后，RT-PCR 检测结果显示，成骨诱导的ag 组、AG 组、AGP 组打印体内hASCs 成骨相关基因RUNX2、OSX 和OCN 的表达高于增殖培养基培养中的各组(P＜0.05)。成骨诱导培养基中的AG OM 组、AGP OM 组明显高于ag OM，增殖培养基中的AG PM 组、AGP PM 组明显高于ag PM，表明与hASCs 共混的纳米羟基磷灰石可促进成骨相关基因表达。

图5 成骨基因表达的RT-PCR 检测结果

3.讨论

生物三维打印的骨组织支架除要求生物相容性外，还需要具有一定的力学强度，以填补骨缺损外形，为新骨形成留出生长空间[7]。在前期实验中，含hASCs 的海藻酸钠/ 明胶水凝胶支架强度较低，进行大尺寸或多层打印时容易发生塌陷。打印完成后通过CaCl2交联形成海藻酸钙，可在短时间后获得稳定的三维结构体，但在体外培养14 天时，部分海藻酸钠/ 明胶结构体出现了解体现象。高分子量的PCL 具有良好的生物相容性，同时因为分子主链中的C-O 键和C-C 键可旋转，具有一定的柔性，冷却成形后不需要有机试剂洗涤等后处理[8]。因此本研究提出了将PCL 与含细胞的水凝胶协同打印的方法。在力学强度测试中，AGP 组三维支架的弹性模量明显大于AG 组，说明双组分支架在抗压强度上较水凝胶支架有所提高，并且AGP 组弹性模量(10.34±0.24MPa)与松质骨(4～12.5MPa)接近[9]，为应用于骨缺损修复提供了可能。

CCK-8 检测及CAM/ PI 染色实验证实在本研究参数条件下熔融PCL 对hASCs 增殖与存活率无明显影响，两组支架的细胞存活率在第7 天时明显高于第1 天(P＜0.05)，原因可能是挤出式印机喷头对细胞挤压，影响细胞活性。有研究报道，PCL在80℃熔融时打印，细丝在20℃环境温度中与打印平台接触时的最高温度为42.4℃[10]。本研究在15℃环境温度及较慢的打印速度下，熔融PCL 落入培养皿中可以快速降温，减少温度变化对hASCs活性的影响。分子量48000～80000 的PCL 在60℃时可熔融[11]，考虑到升高温度可提高熔融PCL 的流动性，更容易挤出成丝，本研究选取80℃作为实验温度。

羟基磷灰石作为天然骨骼的成分之一，具有良好的生物相容性，并且可以促进成骨细胞增殖和迁移，在纳米级状态下可表现出新的性能[12]，将纳米羟基磷灰石与有机材料混合是目前的主要研究方向，如：将纳米羟基磷灰石与聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)共混，可打印具有弹性的骨组织支架[13]；纳米羟基磷灰石/ 胶原复合材料对骨髓单核细胞表现出良好的生物相容性[14]。以往报道已经证实纳米羟基磷灰石在水凝胶体系中对hASCs 的增殖无明显影响[15]，但纳米羟基磷灰石在熔融PCL与水凝胶体系中对hASCs 成骨分化影响鲜有报道。本研究PCR 结果表明，成骨诱导培养后各组基因表达均有所升高，增殖培养基中AG PM 组、AGP PM 组明显高于ag PM 组，说明即使没有成骨诱导培养基的辅助，将纳米羟基磷灰石添加到水凝胶中，与熔融PCL 协同打印后的三维支架仍然可以促进hASCs 成骨向分化。纳米羟基磷灰石对成骨向分化的影响机制目前说法不一，有研究显示纳米羟基磷灰石可以促进分化程度较低的细胞DNA 甲基化[16]，但将细胞与纳米羟基磷灰石短时间共混，碱性磷酸酶相关基因(Alpl)表达会受到抑制，此作用对分化程度较高的细胞影响不明显。这一机制可能能解释AG 组、AGP 中成骨相关基因表达量较高的现象，细胞与纳米羟基磷灰石共混，DNA 甲基化影响成骨细胞形成，分裂增殖后子细胞发生相同的改变。

综上，本实验成功制备了熔融PCL 与水凝胶协同打印的支架结构体，一方面提高了传统水凝胶支架的力学强度，另一方面证实熔融PCL 对hASCs增殖活性不会造成明显影响，纳米羟基磷灰石加入水凝胶体系中可促进hASCs 的成骨相关基因表达。今后本课题组还将对三维支架植入动物体内的情况进一步研究，深入揭示复合支架在骨组织工程中的应用价值。