李洵珣，金 晨，陈 康，程玉瑶，张庆熙，田晓丹，陈 志，张 凌

(江西中医药大学 1.药学院、2.现代中药制剂教育部重点实验室，江西 南昌 330004)

中药可以通过多成分多靶点多通道协同作用，但由于其成分较为复杂、作用机理多不明确等问题，很难通过传统的实验方法来系统且全面地进行分析。网络药理学是一种基于药物、疾病的相关靶点基因以及蛋白质相互作用网络的系统分析方法。能够从整体角度揭示药物的作用机理、协同作用和动态特征，这些特征与中医治疗整体理论的特征相一致，可为新药研发节约成本，使实验更具有针对性。此外，分子对接是基于网络药理学的预测进行进一步分析的手段，使用高精度对接模拟和分子路径图显示配体的选择性，解释配体如何作用于复杂的分子网络，从而评估蛋白质配体的结合潜力。因此，本研究采用网络药理学结合分子对接的方法探讨丰城鸡血藤治疗TNBC的作用机制，并体外实验验证。

1 方法

1.1 数据库与软件TCMSP(http://tcmspw.com/tcmsp.php)；Swiss Target Prediction (www.swissadme.ch/)；Gennecards(https://www.genecards.org/)；OMIM(https://omim.org/)；String(https://string-db.org/)；Bioinformatics & Evolutionary Genomics(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/)；Uniprot(http://www.uniprot.org/)；PDB(https://www.rcsb.org/);Pubchem(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)；Metascape(http://metascape.org/)；Cytoscape3.7.2；R3.6.1；AutoDockTools；Discovery Studio。

1.2 丰城鸡血藤中药活性成分及靶点筛选通过文献挖掘[6-11]以及中药系统药理学数据库与分析平台(TCMSP)、SwissTargetPrediction数据库进行活性成分筛选。文献以“丰城鸡血藤”、“成分”等为检索词在中国知网数据库以及万方数据库中进行搜索得到。使用TCMSP数据库检索丰城鸡血藤中的活性成分，根据中药成分药代动力学(ADME)参数对活性成分进行筛选，将药物口服生物利用度(OB)≥30%以及类药性(DL)≥0.18作为参考标准。SwissTargetPrediction可通过Chemdraw绘制活性成分结构进行代入，设置属性为homosapiens(人类)，筛选其中probability>0.1的活性成分的靶基因进行收集，一共得到丰城鸡血藤共38个潜在活性成分。

1.3 TNBC疾病靶点筛选在Genecards和OMIM数据库中，以“triple-negative breast cancer”为关键词，获取TNBC疾病的相关靶点。

1.4 丰城鸡血藤治疗TNBC靶点筛选利用Bioinformatics & Evolutionary Genomics网站中Draw Venn Diagrams分析工具导入丰城鸡血藤活性成分和TNBC疾病的靶点，通过取交集的方法获取丰城鸡血藤活性成分与疾病共同靶点并绘制韦恩图。

1.5 丰城鸡血藤治疗TNBC分子蛋白靶点网络构建将丰城鸡血藤治疗TNBC有效活性成分和靶点导入Cytoscape3.7.2软件，构建丰城鸡血藤活性成分治疗TNBC分子靶点网络。

1.6 丰城鸡血藤治疗TNBC蛋白互作网络构建以及核心靶点筛选将丰城鸡血藤活性成分与疾病共同靶点导入到String数据库，选择物种为“人类”，设定最低相互作用阈值高等置信度(>0.9)，其余参数保持默认设置，最终获得蛋白相互作用网络(PPI)。将得到的tsv文件导入到Cytoscape3.7.2软件中，利用Network Analyzer功能，根据节点degree值筛选出排名靠前的靶点。

采用SPSS 21.0统计学软件对本组研究对象的临床数据进行分析统计工作,以均数±标准差表示计量数据,以t检验;计数资料采用[n(%)]表示,采用卡方检验。若p<0.05,则表示组间数据对比差异显著,有统计学意义。

1.7 丰城鸡血藤治疗TNBC靶点GO功能富集分析使用Metascape数据库，根据丰城鸡血藤治疗TNBC靶点，进行GO富集分析。根据基因富集数目与显著程度(P<0.05，Q<0.05)，分别选取排名靠前的20条GO生物过程、细胞组成、分子功能，绘制柱状图。

1.8 丰城鸡血藤治疗TNBC靶点KEGG富集分析使用Metascape数据库，根据丰城鸡血藤治疗TNBC靶点，进行KEGG富集分析。根据基因富集数目与显著程度(P<0.05，Q<0.05)，选取排名靠前的20条KEGG通路，绘制气泡图。

1.9 丰城鸡血藤治疗TNBC疾病的重要活性成分和核心靶点对接验证从Uniprot数据库以及PDB数据库中搜索靶点蛋白的PDB ID，同时在Pubchem数据库下载对应成分的三维结构。使用AutoDockTools1.5.6对丰城鸡血藤活性成分以及筛选得到Degree前11个核心靶点进行对接，最后利用分子可视化工具DiscoveryStudio对其对接结果进行可视化处理，并以图片形式展现。

2 结果

2.1 丰城鸡血藤中药活性成分和靶点筛选初步筛选得到丰城鸡血藤治疗TNBC的38个有效中药成分，分别编号为FC1-FC38(Tab 1)，丰城鸡血藤靶点388个，TNBC靶点3 919个，以及丰城鸡血藤治疗TNBC靶点277个(Fig 1)。

Tab 1 List of active ingredients of Callerya nitida var. hirsutissima

Fig 1 Venn diagram of active ingredient targets and disease targets

2.2 丰城鸡血藤治疗TNBC分子靶点网络构建在Cytoscape3.7.2中导入丰城鸡血藤治疗TNBC的活性成分和对应靶点，构建分子靶点网络，包括317个节点，2 232条边。表明丰城鸡血藤抗TNBC机制或是基于多成分、多基因、多靶点的协同作用。

2.3 丰城鸡血藤治疗TNBC的蛋白互作网络构建以及核心靶点筛选根据互作节点个数(degree值)大小进行核心靶点的筛选(Tab 2)，得到了蛋白互作网络(Fig 2)，其中颜色越深、圆形直径越大，代表该靶点与其他靶点的相关性越明显，在网络中处于越重要的地位。筛选出了磷脂酰肌醇3-激酶调节亚基α(PIK3CA)、磷脂酰肌醇3-激酶(PIK3R1)、有丝分裂原激活蛋白激酶1(MAPK1)、酪氨酸蛋白激酶(SRC)、丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶1(AKT1)、信号转导与转录活化因子3(STAT3)等蛋白。互作频次越高，靶点与靶点之间相互作用越大，degree越大，在PPI网络中具有重要作用。其中PIK3CA、PIK3R1、MAPK1、SRC、AKT1的degree值排名前五，提示可能为丰城鸡血藤活性成分治疗TNBC核心靶点。

Tab 2 Targets of Callerya nitida var. hirsutissima in treatment of TNBC

Fig 2 PPI network diagram of core targets

2.4 丰城鸡血藤治疗TNBC的靶点GO功能富集分析将丰城鸡血藤治疗TNBC靶点导入Metascape数据库进行功能分析与通路富集分析，进行GO功能富集分析，共获得生物过程(biologicalprocess，BP)2 668个，主要涉及对多种酶的调控，无机物质与细胞的反应、MAPK级联反应的调控、蛋白质磷酸化过程；细胞组成(cellularcomponent、CC)141个，主要涉及蛋白激酶复合物、丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶复合物、细胞周期蛋白依赖性蛋白激酶全酶复合物、转移酶复合物，转移含磷基团蛋白激酶复合物等；分子功能(molecularfunction，MF)286个，主要涉及蛋白激酶活性、蛋白激酶结合、生长因子结合。将各功能排名前十的生物过程、细胞组成和分子功能绘制成柱状图(Fig 3)。

Fig 3 Bar chart of GO enrichment analysis of Callerya nitida var. hirsutissima active ingredients against TNBC

2.5 丰城鸡血藤治疗TNBC靶点KEGG富集分析根据富集程度和显著性，筛选出了主要的20条KEGG通路(Fig 4)，主要涉及PI3K-AKT信号通路、细胞周期、HIF-1信号通路、甲状腺激素信号通路、FoxO信号通路、癌症中的中心碳代谢、癌症中的MicroRNA等与治疗TNBC有关的通路。

2.6 丰城鸡血藤治疗TNBC的重要中药活性成分和核心靶点对接验证通过文献查找以及参考分子靶点的分布情况筛选出31种中药活性成分与蛋白互作网络筛选出的核心靶点进行对接(Fig 5)，选择共有靶点蛋白-蛋白相互作用(PPI)网络图中关键靶点进行分子对接验证。采用AutodockTools软件将丰城鸡血藤活性成分与关键靶点蛋白进行分子对接分析，一般认为配体与受体蛋白结合的构象稳定时能量越低，发生相互作用可能性越大。当结合能绝对值>4.25则表示具有一定活性，>5.0表示有较好结合活性，而>7.0则可推测其有强烈结合活性。结果见Fig 6,7。

Fig 4 The bubble chart of KEGG enrichment analysis of anti-Triple-negative breast cancer target of Callerya nitida var. hirsutissima active ingredient(The x-axis is the enrichment quantity, and the Y-axis is the pathway)

Fig 5 Molecule docking heat map

Fig 6 Luteolin and PIK3CA

Fig 7 Betulinic acid and CDK1

3 体外TNBC细胞实验验证

3.1 药物来源丰城鸡血藤三氯甲烷提取物由本课题组经70%乙醇提取3次，再利用三氯甲烷萃取得到，经LC-MS以及核磁共振鉴定其部分成分为刺芒柄花素、8-甲雷杜辛、黄氏醌以及 (2S) -1-O-heptatriacontanoyl glycerol等[4]。

木犀草素(陕西慈缘生物技术有限公司，批号：CY191104-06)，白桦脂酸(上海吉至生化科技有限公司，批号：B38540)

3.2 细胞来源人乳腺癌MDA-MB-231细胞(武汉普诺赛生物有限公司)，传至3-10代用于实验。

3.3 丰城鸡血藤有效成分抑制细胞增殖情况使用MDA-MB-231细胞；细胞培养条件为DMEM培养基，含10%胎牛血清和双抗(青霉素10 000 kU·L-1，链霉素10 000 mg·L-1)，置于37 ℃，5% CO2的恒温箱中培养。利用CCK-8法检测木犀草素、白桦脂酸以及丰城鸡血藤三氯甲烷部位提取物对TNBC细胞的半数有效抑制率(IC50)。

结果发现，木犀草素、白桦脂酸以及丰城鸡血藤三氯甲烷萃取部位对MDA-MB-231细胞抑制率随作用时间、作用浓度增加而增加，见Fig 8。木犀草素作用24 h时，其IC50为84.76 μmol·L-1；作用48 h时，其IC50为39.98 μmol·L-1。白桦脂酸作用24 h时，其IC50为49.27 μmol·L-1；作用48 h时，其IC50降低为25.95 μmol·L-1。丰城鸡血藤三氯甲烷萃取部位作用24 h时，IC50为197.4 mg·L-1；作用48 h时，其IC50为139.4 mg·L-1。见Fig 8。

Fig 8 The inhibitory effects of betulinic acid, luteolin and Callerya nitida var. hirsutissima chloroform extracts on TNBC cell proliferation

3.4 划痕实验将细胞接种至背面已画上3条均匀横线的6孔板中,待细胞覆盖后,用200 μL枪头垂直于所画横线进行画线。用1 mL PBS冲洗2遍，加入2 mL无血清DMEM配置的含药培养基进行培养，分别于0、6、18 h于倒置显微镜下观察，如Fig 9所示。

3.5 丰城鸡血藤有效成分相关蛋白表达情况通过收集各组经药物处理24 h的细胞，提取总蛋白，采用BCA蛋白浓度测定试剂盒测定样品蛋白浓度。将处理好的蛋白样品上样进行电泳，蛋白转移到PVDF膜上，转膜完毕将PVDF膜置于5%脱脂奶粉中封闭2 h，一抗4 ℃孵育过夜。1×TBST洗膜3次，每次10 min，二抗孵育2 h，洗膜，显色。

结果表明，经低、中剂量木犀草素、白桦脂酸以及中剂量组丰城鸡血藤三氯甲烷部位提取物处理的TNBC细胞能明显降低VEGFA、AKT、PIK3CA、CDK1、CDK4的表达，见Fig 10。

Fig 10 Effects of luteolin, betulinic acid and chloroformextract of Callerya nitida var. Hirsutissima on VEGFA,AKT, PIK3CA , CDK1, CDK4

4 讨论

乳腺癌已成为威胁女性身心健康的常见肿瘤之一，其发病机制可能与遗传因素、基因突变、机体免疫功能下降、神经功能异常等均有一定关系。中医认为，其内在根源主要在于人体脏腑阴阳失调，或者受到正气内虚给其带来的明显影响，并且致病关键根源可能在于痰浊、气郁、热毒侵蚀或者出现瘀血现象。并且在近年来一些关于三阴性乳腺癌的研究中发现,运用中医药方法治疗有一定成效,因此丰城鸡血藤治疗TNBC具备中医理论基础的支持。

本研究通过分析发现丰城鸡血藤治疗TNBC潜在活性成分主要为木犀草素、白桦脂酸等。有关研究发现木犀草素可通过抑制NF-κB/c-Myc的激活，进而抑制hTERT转录来抑制端粒酶活性，起到抑制乳腺癌增殖、迁移和细胞周期进程并诱导细胞凋亡的作用[12]。白桦脂酸处理后的细胞可导致葡萄糖调节蛋白78(GRP78)过表达，过表达的GRP78激活了内质网(ER)压力传感器PERK。随后的eIF2α磷酸化导致β-catenin表达受到抑制，导致c-Myc介导的糖酵解受到抑制，从而达到抗乳腺癌发展的作用[13]。在PPI蛋白互作结果中可知，PIK3CA、PIK3R1、MAPK1、SRC、AKT1、STAT3、HSP90AA1、APP、CDK1、HDAC1、ESR1的节点较大，推测这些节点可能是治疗TNBC的主要靶点。通过Metascape数据库进行GO以及KEGG富集分析，在GO功能富集分析中主要涉及对多种酶的调控、无机物质与细胞的反应、MAPK级联反应的调控、蛋白质磷酸化等过程；以及在KEGG通路富集分析中主要涉及PI3K-AKT信号通路、细胞周期、HIF-信号通路、甲状腺激素信号通路、FoxO信号通路、癌症中的中央碳代谢、癌症中的MicroRNA等与治疗TNBC有关的通路。均提示丰城鸡血藤治疗TNBC的潜在作用机制多集中在影响细胞增殖、转移以及凋亡等生物过程。

本研究应用网络药理学以及实验验证发现,丰城鸡血藤可通过多化合物、多靶点、多通路作用于TNBC。PIK3CA以及PIK3R1均属于PI3K基因家族的成员。磷酸肌醇3-激酶(PI3K)通路的失调有助于肿瘤的发展和进展。PIK3CA突变可导致HR+/HER2-转移性乳腺癌预后较差[14]。有关研究发现,刺激AKT信号通路在乳腺肿瘤中发挥促癌作用[15-16],当药物抑制AKT信号传导可使细胞周期阻滞从而达到抑制。临床研究中也将CDK4抑制剂作为治疗的手段之一[17]。研究还发现接受免疫治疗的非转移性乳腺癌相比，转移性乳腺癌中CCNA2的表达增加，并且研究中CCNA2在癌组织中的表达较正常对照升高，提示抑制CCNA2的表达可抑制TNBC的转移[18]。研究也发现新血管形成是肿瘤形成的必要条件之一，VEGFA作为一种血管内皮生长因子在肿瘤的发生发展中将起到至关重要的作用。因此，在治疗上可考虑从抑制血管生长、细胞增殖以及侵袭等途径抑制TNBC的发展。

在体外验证实验中，利用CCK-8法测定丰城鸡血藤三氯甲烷部位萃取物以及单体化合物木犀草素、白桦脂酸对细胞增殖的抑制率，结果显示均有一定的抑制作用，其中白桦脂酸以及木犀草素能在低浓度对TNBC细胞增殖有抑制作用。Western blot检测蛋白表达可知，在给药浓度范围内各组均能抑制VEGFA、AKT、PIK3CA、CDK1、CDK4的表达，可通过PI3K-AKT通路以及周期蛋白阻滞细胞周期，也可通过抑制VEGFA的表达以及细胞增殖，在生物体内可抑制血管生长，也进一步验证了网络药理学的预测。网络药理学为中药研究提供一种新方法，为药理研究提供了理论基础以及实验依据。