刘文军，尚东维,，于小涵，崔培，杨燕菁，孙金辉,通信作者

（1. 天津嘉禾田源观赏鱼养殖有限公司，天津301809；2. 天津农学院 水产学院，天津 300392）

线纹海马（Hippocampus erectus）是原产于美洲地区的中型体格海马，主要分布在大西洋西海岸。2009年该海马被人工繁育成功并引入中国，因其生长速度快、成活率高、抗病能力强而被迅速推广，成为目前我国海马养殖的主要种类之 一[1-2]。然而随着养殖规模不断扩大，线纹海马病害发生情况也越加严重[3]。其中细菌性疾病是造成线纹海马死亡的重要原因，例如假单胞菌[4]、海马分枝杆菌[5]、溶藻弧菌[6]、坎氏弧菌[4]等均可引起海马不同程度死亡。

2016年5月，天津某养殖场线纹海马暴发疾病，患病海马尾部多表现出溃疡表征，腹部积水，并伴有肠炎症状。此次试验从濒死线纹海马肝胰脏中分离得到一株优势菌种，经鉴定为副溶血弧菌（Vibrio parahaemolyticus）。副溶血弧菌属于弧菌科、弧菌属，是一种嗜盐性、嗜温性的革兰氏阴性短杆菌，主要生活在海洋、盐湖和鱼虾贝类等海产品中，能够感染鱼类、对虾、文蛤、杂色鲍（九孔鲍）等，引起水生动物疾病[7-8]，对水产养殖行业造成危害。尽管副溶血弧菌作为海马条件致病菌已有报道[9]，但迄今尚未见有引起线纹海马感染发病的报道。本研究从濒死线纹海马肝胰脏分离到副溶血弧菌，用形态学观察、生理生化鉴定结合16Sr RNA基因序列分析等方法进行菌株鉴定，同时开展药敏试验，旨在丰富该菌在宿主范围、生物学性状及分子生物学等方面的内容，并为海马疾病防治工作提供科学参考。

1 材料与方法

1.1 细菌的分离纯化及形态学观察

参照杨弘诣等[9]的方法进行，用灭菌过滤海水冲洗体表溃疡部位，无菌操作摘取患病海马肝胰脏组织，碾碎后用0.87%的无菌型氯化钠溶液（按1∶1比例）研磨，接种于MA 2216培养基（消化蛋白5.0 g，磷酸高铁0.1 g，琼脂15.0 g，陈海水1 000 mL，pH＝7.5～7.6）上，28 ℃恒温分离培养细菌18～24 h，取优势菌的菌落于MA 2216琼脂培养基平面（28 ℃培养24 h）进行划线培养，挑取单个菌落用2216液体培养基（消化蛋白5.0 g，磷酸高铁0.1 g，陈海水1 000 mL，pH＝7.5～7.6）培养，得到纯菌株（编号为Par-1）。待测菌株Par-1于MA 2216琼脂平面上（29±1）℃培养16～18 h后，制备涂片标本进行革兰氏染色，做形态特征检查。最终将浓度为20%的甘油与菌液1∶1混匀，配成菌悬液保藏于-80 ℃冰箱。

1.2 生理生化特征检查

采用弧菌科细菌微量生化鉴定管对待测菌株进行各项指标测定，包含项目如下：1% NaCl葡萄糖、1% NaCl葡磷胨水（VP）、1% NaCl蛋白胨水（靛基质）、1% NaCl蔗糖、1% NaCl甘露糖、1% NaCl阿拉伯糖、1% NaCl肌醇、1% NaCl赖氨酸脱羧酶、1% NaCl精氨酸双水解酶、无盐胨水、3% NaCl胨水、6% NaCl胨水、8% NaCl胨水、10% NaCl胨水、硝酸盐还原、半固体（动力）、氧化酶试纸、接触酶试验，弧菌生化管接种细菌后（29±1）℃培养24 h观察，其中氨基酸测定项目观察时间延长至7 d。参照相关文献[10-11]对病原菌进行鉴定。

1.3 16S rRNA序列测定分析

挑取纯化菌株于MA 2216 液体培养基中，在恒温培养振荡器中温度28 ℃，转速180 r/min振荡培养12～18 h至菌液浑浊。取2 mL菌液于离心管中，用台式高速冷冻离心机（冷却至4 ℃）12 000 r/min离心2 min。弃去上清液，利用水煮法[12]提取DNA，向离心管中加入500 μL无菌双蒸水，涡旋30 s，然后用电热恒温水温箱95 ℃水浴5 min，再12 000 r/min离心2 min，以上清液为DNA模板，-20 ℃保存备用。用细菌16S rRNA通用引物进行PCR扩增，27F：5′-AGAGTTTGA CCTGGCTCAG-3′和1 492R：5′-GGTTACCTTGTA CGACTT-3′。PCR扩增反应体系（20 μL）：无菌双蒸水7 μL，Mix体系10 μL，模板DNA 1 μL，上下游引物各1 μL。PCR扩增反应条件为：94 ℃预变性5 min，95 ℃变性45 S，55 ℃退火30 S，72 ℃延伸1 min，30个循环后，72 ℃再延伸10 min。用琼脂糖凝胶电泳检测PCR结果，扩增产物交由北京金维智生物科技有限公司测序。将16S rRNA序列通过NCBI的Blast检索系统进行同源性分析，再用MEGA 5.1软件进行多序列匹配分析，最后采用邻位相连法（Neighbor-joining method）构建系统发育树。

1.4 人工感染试验

参照杨求华等[13]的方法将菌株Par-1接种于MA 2216液体培养基上，28 ℃恒温培养18～24 h，采用麦氏比浊仪法将分离纯化的细菌用无菌生理盐水配置成密度为3.59×108CFU/mL的菌悬液。将菌悬液经2 000 r/min，4 ℃离心10 min，除去上清液，加0.87% NaCl 进行稀释。选取56条线纹海马随机分为7组，每组8条。其中6组为试验组，1组为对照组。试验组分设6个梯度，菌液浓度分别为3.59×1011、3.59×1010、3.59×109、3.59×108、3.59×107、3.59×106CFU/mL，用50 μL尖头微量进样器从每尾海马胸鳍基部向胸腹腔内注射菌悬液20 μL，对照组注射浓度为0.87%的同等剂量的生理盐水。试验期间控制水温在（25±1）℃、盐度22，连续充气14 d，观察记录线纹海马发病和死亡情况，并选取病死线纹海马进行细菌分离和鉴定，观察分离菌株在形态及生理生化特性上是否与原分离菌株一致。

1.5 药敏试验

采用常规Kriby-Bauer纸片扩散法进行药敏试验，选用30种抗生素对分离菌株进行药敏试验，在无菌条件下操作，将Par-1菌悬液涂布于2216E平板上，用镊子将药敏纸片贴于培养基表面，按编号分别贴上不同的药敏纸片，然后置于28 ℃恒温箱中培养24 h，测量抑菌圈的直径，根据药敏试验判断标准确定该菌对不同药物的敏感程度。试验重复3次，计算平均值，以判定菌株对抗生素的敏感性。

2 结果与分析

2.1 Par-1菌株的形态特征及生理生化特性

患病海马皮肤表面多出现溃疡表征，腹部积水，并伴有肠炎症状。从患有溃疡的海马表皮中分离获得1株细菌，命名为Par-1，该菌株在MA 2216培养基上的菌落为白色近圆形、边缘不规则、不透明、表面湿润。细菌染色镜检为革兰氏阴性短棒状菌，两端着色深。生理生化检测结果表明，Par-1细菌具运动性，氧化酶、触酶、硝酸盐还原试验均呈阳性；精氨酸双水解酶阴性；赖氨酸脱羧酶阳性；利用葡萄糖产酸不产气、利用蔗糖、甘露醇，不利用阿拉伯糖、肌醇；无盐胨水不生长，3% NaCl胨水、6% NaCl胨水、8% NaCl胨水、10% NaCl胨水均生长（表1），初步判定细菌为副溶血弧菌（Vibrio parahaemolyticus）。

表1 病原菌Par-1生理生化特征

2.2 基因序列分析结果及其系统发育进化树

以分离菌株Par-1基因组DNA为模板，采用PCR扩增其16S rDNA 序列产物进行琼脂糖电泳显示目的条带大小约为1 450 bp（图1），测序获得 16S rRNA 序列片段为1 418 bp。通过 NCBI-Blast 同源性分析发现病原菌的16S rRNA 基因与副溶血弧菌（KR347251.1和KR347253.1）的同源性达100%。从GenBank数据库中下载相关序列并且进行校正，采用MEGA 5.1软件构建系统发育树，结果显示病原菌与副溶血弧菌聚为一支（图2），最终鉴定分离菌株Par-1为副溶血弧菌（V. parahaemolyticus）。

图1 Par-1菌株16S rRNA PCR产物电泳图

图2 Par-1 16S rDNA系统发育树分析

2.3 人工感染试验结果

回接感染试验结果显示，3.59×1011、3.59×1010、3.59×109、3.59×108CFU/mL 4个梯度的线纹海马在48 h内死亡率达到100%，3.59×106CFU/mL组在感染进行7 d内的死亡率为75%。人工感染后线纹海马死亡率统计见表2。

表2 Par-1人工再感染试验结果

对照组在试验期间无病理变化和死亡现象。感染后的线纹海马临床表现与自然发病海马症状相同，都主要表现为鱼体表面有溃疡病征，肠道内有腹水，并且从已死亡的线纹海马皮肤及肝脏再次分离得到与Par-1菌落形态、生理生化特征相同的菌株。对照组线纹海马无死亡现象。

2.4 药敏试验结果

选用30种抗生素进行药敏试验，结果显示该菌株对亚胺培南、美罗培南、头孢噻肟、阿齐霉素、诺氟沙星、链霉素、四环素、萘啶酸、新霉素、卡那霉素、庆大霉素、依诺沙星、阿米卡星、恩诺沙星、左氟沙星、呋喃妥因、氯霉素、氟苯尼考、万古霉素、甲氧嘧啶、磺胺异恶唑、复方新诺明等22种药物敏感，对头孢哌酮、头孢克肟、头孢氨苄、阿莫西林、氨苄西林、利福平、克林霉素等7种药物耐药，对红霉素中度敏感（表3）。

表3 副溶血弧菌Par-1菌株的药敏试验结果

3 讨论

副溶血弧菌是一种广泛分布于近海岸及海产品中的嗜盐性菌，是一种人与水产养殖动物共染的病原菌[14-15]。已有研究报告表明，其致病性有两个明显的特征：一是广泛致病性，即在鱼、虾、蟹、贝类等水产养殖动物中均存在广泛的致病作用。高磊等[16]从发病石斑鱼中分离得到副溶血弧菌，并在此基础上进行形态特征、PCR鉴定、毒力鉴定检测试验，证实副溶血弧菌可引起健康石斑鱼发病；赵吉臣等[17]通过人工注射感染试验证明副溶血弧菌可作为病原菌侵入墨吉明对虾机体内；阎斌伦等[18]从养殖病死三疣梭子蟹肝胰脏及心脏血淋巴液中分离到大量优势生长的副溶血弧菌，人工感染试验证明分离菌对三疣梭子蟹有较强的致病性。邓先余等[19]经形态、生理、生化、回归感染试验等多项指标鉴定出工厂化养殖杂色鲍的致病菌为副溶血弧菌（Vibrio parahaemolyticus），并经ATB微生物自动鉴定系统证实鉴定结果。本研究从患病线纹海马体内分离得到1株菌株Par-1，通过对分离菌进行了主要理化特性方面较系统地检验及系统发育学分析，表明所检出的病原菌为副溶血弧菌；此外，Par-1纯培养物可在短时间内使健康线纹海马患病甚至死亡，其症状与自然发病海马病灶部位表现一致，半数致死浓度为5.01×106CFU/mL，进一步揭示了该菌在水产养殖动物中的广泛致病作用。二是条件致病性，即水产养殖动物在受到胁迫时，易被感染并引发疾病或死亡，胁迫可能来自于水温等环境因子、水产养殖动物的生理状态、细菌数量、其他致病菌入侵等。从已有的研究资料中不难发现，温度是决定养殖环境中副溶血弧菌能否产生致病性的主要因素之一，如在阎斌伦等[18]研究中的三疣梭子蟹及樊景凤等[20]研究中的凡纳滨对虾发病在7月，而本研究中线纹海马发病在5月，表明该菌多在5～10月，尤其是6～9月大量繁殖，主要原因是该季节水温较高，水质易恶化，易滋生致病菌。因此，高温季节应加强管理，保持良好的水质是降低副溶血弧菌致病性的主要途径。

使用抗菌药物依然是治疗水产养殖动物细菌性感染最主要的手段。根据来源不同，可将抗菌药物分为抗生素和人工合成抗菌药。在副溶血弧菌对抗菌类药物敏感性的研究方面，阎斌伦等[18]报道引起江苏地区河蟹暴发性流行病的副溶血弧菌对新霉素等42种药物高度敏感，对林可霉素敏感，对青霉素G等6种耐药；刘荭等[21]发现氟哌酸、红霉素、青霉素和强力霉素等4种药物对斑节对虾的副溶血弧菌有显著抑制作用；张朝霞等[22]报道分离于九孔鲍的副溶血弧菌对链霉素、丁胺卡那霉素、氯霉素、庆大霉素、壮观霉素、妥布霉素、强力霉素、多黏菌素B、复方新诺明、磺胺甲基异噁唑等药物高度敏感，对四环素、新霉素、头孢噻肟、环丙沙星等中度敏感，对红霉素、新生霉素、万古霉素、氟哌酸、呋喃唑酮、氨苄青霉素、呋喃妥因等耐药。本研究通过对30种抗生素进行药敏试验发现，Par-1菌株对四环素、氟苯尼考、新霉素、复方新诺明、恩诺沙星、甲氧苄啶、庆大霉素、诺氟沙星等22种药物敏感，对头孢哌酮、头孢克肟、头孢氨苄、阿莫西林、氨苄西林、利福平、克林霉素等7种药物耐药。从上述结果可以看出，分离于不同水产养殖动物的副溶血弧菌对抗菌药物的耐药性存在一定差异，这可能与养殖环境等因素有关，具体的作用机制需要进一步深入研究。目前，我国农业部批准使用的水产养殖动物国标兽药抗菌药物有14个品种，包括本研究中线纹海马副溶血弧菌菌株对之敏感的氟苯尼考粉（水产用）、硫酸新霉素粉（新霉素，水产用）、复方磺胺甲噁唑粉（复方新诺明，水产用）、恩诺沙星和复方磺胺嘧啶粉（甲氧苄啶，水产用）。因此，在养殖生产中可适度选用氟苯尼考、新霉素、复方新诺明、恩诺沙星和甲氧苄啶等抗菌药物控制天津地区线纹海马的副溶血弧菌病。但需要注意的是，目前对副溶血弧菌所引起的养殖线纹海马疾病的诊断仍是根据常规的临诊观察和细菌学检查，在确定病原种类的过程中缺乏及时性和准确性，无法满足疾病防治的要求[23]，因此未来寻找该病原的快速检测方法将成为疾病防治的重点工作之一。