董心宜，陈慧慧，张宇薇，王英超,通信作者，张桂霞，王瑞玺

（1. 天津农学院 a. 基础科学学院，b. 园艺园林学院，天津 300392；2. 天津市大蒲地家庭农场，天津 301600）

黑果腺肋花楸（Aronia melanocarpa）属蔷薇科，原产于北美地区，欧洲有上百年引种栽培历史[1]。我国于20世纪90年代开始引入，在辽宁、吉林、山东、天津和黑龙江均有栽培。黑果腺肋花楸果实富含花青素、黄酮、多酚等活性物质[2]，目前已知果实中含量最高的活性物质为多酚类物质[3]。研究表明，黑果腺肋花楸果实中的多酚类物质具有很强的清除自由基、降血脂、降血糖和调节免疫系统等功能[4]。

多酚的纯化方法有溶剂萃取法、金属离子沉淀法、凝胶柱层析分离纯化法、大孔树脂吸附法、超临界萃取法和膜分离法[5]，其中大孔树脂吸附法是一种应用非常广泛的纯化方法。大孔吸附树脂具有稳定性好、富集效果明显、吸附容量大、选择性好、解吸条件温和、再生处理方便、使用周期长、节省费用等诸多优点，广泛用于活性物质的分离纯化。国外对于黑果腺肋花楸的研究主要集中在果实加工和功能性产品研发方面[6-7]。国内对于黑果腺肋花楸的研究正处于起步阶段，对于多酚纯化的研究报道较少，如李斌等[4]、张卉等[8]、高凝轩[9]采用XAD-7大孔树脂纯化黑果腺肋花楸中的多酚，纯度达到64.37%～74.26%。但XAD-7树脂价格昂贵，在实际工业生产中生产成本偏高，因此筛选一种高性价比的树脂尤为重要。

笔者以黑果腺肋花楸冻果的多酚提取液为原料，采用AB-8、ADS-17、HPD-100和NKA-Ⅱ 4种大孔树脂对多酚进行纯化，并确定最佳纯化工艺，以期筛选出高性价比树脂，旨在为黑果腺肋花楸多酚类物质的研究利用提供方法和理论参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

黑果腺肋花楸采自天津市静海区。挑选成熟度一致、无病虫害和损伤的果实，清洗干净，控干果实表面水分，-20 ℃保存。

AB-8大孔树脂、NKA-II大孔树脂、HPD-100和ADS-17大孔树脂购自天津市光复精细化工研究所；无水乙醇购自天津市津东天正精细化学试剂厂；福林酚、没食子酸标准品购自上海源叶生物科技有限公司。无水碳酸钠、NaOH、HCl均为分析纯。

1.2 仪器与设备

BSA223S电子分析天平，赛多利斯科学仪器（北京）有限公司；YS-08小型高速粉碎机，北京燕山正德机械设备有限公司；Alpha-1500紫外可见分光光度计，上海谱元仪器有限公司；HL-2B数显恒流泵，上海嘉鹏科技有限公司；BS-100A自动部份收集器，上海沪西分析仪器厂有限公司；HNY-100B恒温培养振荡器，天津市欧若仪器仪表有限公司；R-300旋转蒸发仪，BUCHI公司；FD5-3真空冷冻干燥仪，SIM（USA）International Group CO.。

1.3 方法

1.3.1 黑果腺肋花楸多酚的提取

称取黑果腺肋花楸冻果解冻后按料液比1∶5（g：mL）加入50%乙醇溶液，混匀后置于三角瓶中。在40 ℃、超声功率200 W的条件下提取40 min，4 000 r/min离心10 min，旋蒸除去滤液中的乙醇，冷冻干燥后得到粗提物冻干粉，测定多酚含量，使用时按照试验需要配制溶液备用。

1.3.2 多酚含量测定及标准曲线绘制

1.3.2.1 样品含量测定

移取0.1 mL待测样品溶液于25 mL刻度试管中，依次加入2 mL蒸馏水、0.5 mL福林酚，静置3 min后加入2 mL 10% Na2CO3，用蒸馏水定容至刻度，摇匀，室温避光放置2 h，在760 nm波长下测定吸光度值。

1.3.2.2 标准曲线绘制

分别移取1 mg/mL没食子酸对照品溶液0、0.050、0.075、0.100、0.125、0.150、0.200、0.250、0.300、0.350 mL于25 mL刻度试管中，依次加入2 mL蒸馏水、0.5 mL福林酚试剂，静置3 min后加入2 mL 10%Na2CO3，用蒸馏水定容至刻度，摇匀，室温避光放置2 h，在760 nm波长下测定吸光度。

以吸光度值为纵坐标、浓度为横坐标，绘制标准曲线，从而得到线性回归方程：y＝89.185x- 0.050 5（R²＝0.991 5）。样品中多酚含量根据公式（1）计算。

式中：C——黑果腺肋花楸多酚含量，mg/mL；A——吸光度；N——提取液稀释倍数。

1.3.3 大孔树脂预处理

称取适量4种大孔树脂置于无水乙醇中密封浸泡，于30 ℃、120 r/min条件下振荡24 h，振荡结束后，用无水乙醇冲洗至流出液与蒸馏水体积比1∶3并混合无白色浑浊时，用蒸馏水冲洗至无醇味，然后将树脂过滤并吸干多余水分，备用。

1.3.4 吸附与解吸试验筛选最佳树脂

称取预处理后的4种大孔树脂各2.0 g于250 mL锥形瓶中，分别加入黑果腺肋花楸多酚提取液50 mL，在30 ℃、120 r/min条件下避光振荡24 h后，取适量上清液测定多酚质量浓度，根据公式（2）计算树脂吸附量。

式中：C0——吸附前提取液中多酚质量浓度，mg/mL；C1——吸附平衡时上清液中多酚质量浓度，mg/mL；V——供试液体积，mL；M——树脂质量，g。

将避光振荡24 h后的4种树脂过滤并用蒸馏水冲洗至表面无多酚提取液残留物，然后过滤树脂并吸干多余水分，加入50 mL 60%乙醇溶液，在30 ℃、120 r/min条件下避光振荡24 h后，取适量上清液测定多酚质量浓度，根据公式（3）计算解吸率。

式中：C0——吸附前提取液中多酚质量浓度，mg/mL；C1——吸附平衡时上清液中多酚质量浓度，mg/mL；C2——解吸液中多酚质量浓度，mg/mL。

1.3.5 AB-8大孔树脂静态吸附与解吸试验

1.3.5.1 静态吸附动力学曲线

称量2 g预处理后的AB-8树脂，加入30 mL黑果腺肋花楸多酚提取液，在30 ℃、120 r/min条件下避光振荡，每隔1 h取适量上清液测定多酚含量，计算树脂吸附量。以取样时间（h）为横坐标、树脂吸附量（mg/g）为纵坐标，绘制静态吸附动力学曲线。

1.3.5.2 上样液pH值对静态吸附量的影响

用NaOH和HCl溶液调节黑果腺肋花楸多酚提取液的pH分别为2、4、6、8、10。称量5份预处理后的AB-8树脂，分别加入30 mL不同pH的黑果腺肋花楸多酚提取液，在30 ℃、120 r/min条件下避光振荡24 h，取适量上清液测定多酚质量浓度，计算解吸率。

1.3.5.3 乙醇体积分数对静态解吸率的影响

称量6份预处理后的AB-8树脂，分别加入30 mL 黑果腺肋花楸多酚提取液，在30 ℃、120 r/min条件下避光振荡24 h。取上清液测定多酚质量浓度，计算树脂吸附量。然后将树脂过滤后洗去残留的多酚并吸干多余水分，分别加入40 mL 30%、40%、50%、60%、70%、80%的乙醇溶液，在30 ℃、120 r/min条件下避光振荡24 h，取上清液测定多酚质量浓度，计算解吸率。

1.3.6 AB-8大孔树脂动态吸附与解吸试验

1.3.6.1 上样流速对吸附效果的影响

准确称量预处理后的AB-8树脂16.0 g，湿法装柱，待树脂平衡后，分别以1.0、2.0、3.0 mL/min的流速对黑果腺肋花楸多酚提取液进行上样，每管收集5 mL流出液，测定每管流出液多酚质量浓度。

1.3.6.2 洗脱流速对洗脱效果的影响

准确称量预处理后的AB-8树脂16.0 g，湿法装柱，待树脂平衡后，以1.0 mL/min的流速对黑果腺肋花楸多酚提取液进行上样直至树脂达到吸附饱和，测定流出液中多酚质量浓度，计算树脂吸附量。然后用70%乙醇溶液洗脱，洗脱速度分别为0.5、1.0、1.5 mL/min，每管收集5 mL流出液，测定每管流出液多酚质量浓度。

1.3.7 AB-8大孔吸附树脂对黑果腺肋花楸多酚的纯化效果

根据公式（4）和公式（5）计算多酚的收率和纯度。

式中：C0——吸附前提取液中多酚质量浓度，mg/mL；V0——吸附前提取液的体积，mL；C2—— 解吸液中多酚质量浓度，mg/mL；V2——解吸液体积，mL；C——多酚质量浓度，mg/mL；V——溶液体积，mL；M——冻干粉质量，mg。

2 结果与分析

2.1 大孔树脂的筛选

以树脂吸附量和解吸率为标准，对AB-8、ADS-17、HPD-100、NKA-II 4种大孔树脂进行筛选，结果见图1。由图1可知，4种大孔树脂中，吸附量最高的是HPD-100树脂，为0.082 2 mg/g；其次是AB-8树脂，为0.070 2 mg/g；NKA-II树脂的吸附量最低，只有0.048 5 mg/g。解吸率最高的是AB-8树脂，为70.22%；其次是ADS-17树脂，为61.93%；HPD-100的解吸率最低，为39.76%。综合考虑，选择吸附量和解吸率都相对较好的AB-8大孔树脂作为最佳纯化树脂。

图1 4种大孔树脂对黑果腺肋花楸多酚的静态吸附量和解吸率

2.2 AB-8大孔树脂静态吸附与解吸试验

2.2.1 静态吸附动力学曲线

由图2可知，随着时间的延长，AB-8大孔树脂吸附量逐渐增加。3 h后吸附量明显放缓。出现这种现象的原因可能是由于3 h后大孔树脂吸附趋于饱和。因此，选用AB-8大孔树脂纯化黑果腺肋花楸多酚时，静态吸附时间选择3 h最佳。

图2 AB-8大孔树脂静态吸附动力学曲线

2.2.2 上样液pH对静态吸附量的影响

上样液pH对AB-8大孔树脂静态吸附量的影响见图3。由图3可知，吸附量随样液pH的增大呈先增加后减小的趋势，在pH为4 时，吸附量达到最大值。这是由于上样液pH的变化，可以改变目标成分在溶液中的存在形式，改变溶液极性，影响目标成分与大孔吸附树脂分子间作用力。花楸多酚中含有大量酚羟基，呈酸性，在酸性条件下比较稳定，从而利于大孔树脂对多酚的吸附[8，10]。综上所述，使用AB-8树脂纯化黑果腺肋花楸多酚时不需要调节样液pH。

图3 上样液pH对AB-8大孔树脂静态吸附量的影响

2.2.3 乙醇体积分数对静态解吸率的影响

乙醇体积分数对解吸率的影响见图4。如图4所示，随着乙醇体积分数的提高，解吸率呈先升高后降低的趋势。当乙醇体积分数达到70%时，解析效果最好，解吸率为82.36%。当乙醇体积分数超过70%时，增加了其他醇溶性物质与多酚的竞争性溶出[11]，从而使多酚的解吸率下降。因此，选择70%乙醇作为AB-8大孔树脂的洗脱剂。

图4 乙醇体积分数对AB-8大孔树脂静态解吸率的影响

2.3 AB-8大孔树脂动态吸附与解吸试验

2.3.1 上样流速对吸附效果的影响

不同上样液流速对AB-8大孔树脂吸附效果的影响见图5。以1.0、2.0、3.0 mL/min的流速对样液进行上样，流速为1.0 mL/min和2.0 mL/min时泄漏点出现较迟，在流出液体积为15 mL时，流速为3.0 mL/min时泄露出现最早，在流出液体积为10 mL时，随着流出液体积的增加，不同流速下流出液中多酚质量浓度也在增加，流速为3.0 mL/min时，流出液中多酚质量浓度增加速度最快，流速为2.0 mL/min时次之，流速为1.0 mL/min时最慢。这是因为上样流速过快会导致黑果腺肋花楸多酚与大孔树脂接触时间过短而使得吸附效果降低，但流速过慢会使得试验周期过长，在2.0 mL/min流速下，流出液达到80 mL后，流出液多酚质量浓度增长速度较快，说明大孔树脂对多酚的吸附效果降低，逐渐接近饱和。因此，将2.0 mL/min作为较佳上样流速，最佳上样量为80 mL。

图5 上样流速对吸附效果的影响

2.3.2 洗脱流速对洗脱效果的影响

在同一吸附条件下，洗脱流速对洗脱效果的影响见图6。由图6可知，洗脱流速为1.5 mL/min时，流出液多酚含量最低，洗脱速度过快使乙醇不能与多酚更好的接触导致出现拖尾现象；洗脱流速为1.0 mL/min时，流出液多酚含量居第二，但洗脱效果最好；洗脱流速为0.5 mL/min时，流出液多酚含量最高，但由于洗脱速度过慢从而延长了洗脱时间。综上所述，选择洗脱流速为1.0 mL/min，此流速下最佳洗脱体积为60 mL。

图6 洗脱流速对AB-8大孔树脂洗脱效果的影响

2.3.3 AB-8大孔吸附树脂对黑果腺肋花楸多酚的纯化效果

利用福林酚比色法，对黑果腺肋花楸多酚提取液和经AB-8大孔树脂动态吸附-解吸纯化后的多酚进行测定。结果显示，利用AB-8大孔树脂纯化后，多酚纯度从10.80%提高到了52.20%，回收率为80.56%。证明AB-8大孔吸附树脂对黑果腺肋花楸多酚的纯化效果较好。

3 结论

通过比较AB-8、ADS-17、HPD-100、NKA-II 4种大孔树脂对黑果腺肋花楸多酚吸附-解吸效果，筛选出AB-8大孔树脂对黑果腺肋花楸多酚的纯化效果最好，其最佳静态吸附-解吸工艺参数为：吸附时间3 h、上样液pH＝4、乙醇体积分数70%；其最佳动态吸附-解吸工艺参数为：上样流速2.0 mL/min、最佳上样量80 mL、洗脱流速1.0 mL/min、最佳洗脱体积60 mL。黑果腺肋花楸多酚纯度由10.80%提高到52.20%，表明AB-8大孔树脂能够较好地纯化黑果腺肋花楸多酚。

AB-8大孔树脂价格低廉，是XAD-7大孔树脂价格的1/10，虽然对黑果腺肋花楸多酚的纯化效果略低于XAD-7大孔树脂，但在工业批量生产中能够节约大量生产成本，间接提高企业的经济效益。