熊 颖，禹 霖，柏文富，聂东伶，李建挥，严佳文，吴思政

（1.湖南省植物园 经济植物研究所，湖南 长沙 410116；2.湖南省蓝莓研究发展中心，湖南 长沙 410116）

花青素为黄酮类化合物，广泛存在于植物体内[1]，具有抗氧化[2]、抗衰老[3]、保护视力[4-5]、抗癌[6-7]、抑菌[8]、调节肠道菌群[9]等功效。因此，花青素在食品、化妆品、药品等工业领域应用范围较广。蓝莓因花青素含量高、食用价值高而受到广泛关注。蓝莓不仅是一种理想的鲜食水果，还可被加工成各种休闲食品，具有较高的经济价值和广阔的发展前景。

目前，国内外对蓝莓果实的研究主要集中在不同品种的加工特性、采后保鲜、抗氧化的对比以及相关产品研发等方面[10-13]。我国蓝莓种植面积广，蓝莓深加工发展迅速，但加工过程中产生的下脚料利用程度有限，有研究结果表明蓝莓果酒或果汁生产过程中产生的酒渣或果渣中仍残留大量花青素[14-15]。目前，关于蓝莓果渣高效利用的研究报道较多，但关于蓝莓酒渣高效利用的研究报道较为鲜见[16-18]。蓝莓酒渣若不能得到充分利用会造成极大的资源浪费和环境污染。为充分利用蓝莓资源，提高蓝莓花青素的利用效率，对蓝莓酒渣中花青素进行高效提取和利用势在必行。

本研究中以蓝莓酒渣为原料，使用乙醇-柠檬酸提取花青素，在单因素试验的基础上，采用响应面法对蓝莓酒渣花青素的提取工艺进行优化，并使用高效液相色谱仪对蓝莓酒渣中的花青素组成进行分析，旨在完善蓝莓酒渣花青素高效提取工艺，为蓝莓酒渣的高效利用提供参考。

1 材料与方法

1.1 原料与试剂

蓝莓鲜果为采自湖南省植物园蓝莓园的‘灿烂’蓝莓，蓝莓酒渣为‘灿烂’蓝莓鲜果经纯酿后的下脚料。无水乙醇、KCl、醋酸钠、HCl、柠檬酸等均为分析纯，产自国药集团化学试剂有限公司；甲酸、乙腈均为色谱纯，产自美国Sigma公司。

1.2 仪器与设备

DHG-9070A 恒温鼓风干燥箱购于中国上海一恒公司，HJ-4A 恒温磁力搅拌器购于江苏金坛市金城国胜实验仪器厂，WF-04B 粉碎机购于永康市伟峰电器厂，UV1200 紫外可见光分光光度计购于上海美谱达仪器公司，Centrifuge 5418 离心机购于德国Eppendorf 公司，1260 型高效液相色谱仪（配有紫外检测器）购于美国Agilent 公司，Agile ZORBAX SB-C18 分析型色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）购于美国Agilent 公司。

1.3 试验方法

1.3.1 花青素提取

蓝莓酒渣经自然干燥后，用粉碎机粉碎，过80 目筛，用石油醚脱脂后，于45 ℃条件下烘至恒质量，将烘干后的蓝莓酒渣粉密封保存于4 ℃冰箱内。配制体积分数分别为40%、50%、60%、70%和80%的酒精水溶液，并用柠檬酸调节溶液pH 至2、3、4、5、6，密封备用。

称取(1.00±0.01)g 蓝莓酒渣粉，分别与10、15、20、25、30 mL 不同体积分数的酒精水溶液混合均匀，然后在30、40、50、60、70 ℃条件下搅拌提取0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 h，将混合物于4 000 r/min 条件下离心5 min，取上清液，并用对应溶剂定容至溶剂的初始体积得提取液。分析乙醇体积分数、提取温度、料液比、提取时长和溶剂pH 对蓝莓酒渣花青素提取的影响。

1.3.2 总花青素含量测定

参照文献[19]采用pH 示差法并稍加调整，测定提取液总花青素含量。分别取0.1 mL 提取液于2个试管中。向其中1 支试管中加入4.9 mL的KCl-HCl 缓冲液（pH=1），摇匀后避光静置50 min，分别测定待测液在510 nm 波长处的吸光度（A510），在700 nm 波长处的吸光度（A700）。向另1 支试管中加入4.9 mL 的NaAc-HCl 缓冲液（pH=4.5），摇匀后避光静置50 min，分别测定待测液在510 nm 波长处的吸光度（A510′），在700 nm 波长处的吸光度（A700′）。

花青素质量分数（ω）以蓝莓酒渣中矢车菊-3-O-葡萄糖苷当量表示，计算公式为

式中：M为矢车菊-3-O-葡萄糖苷的相对分子质量449.2 g/mol；D为稀释倍数50；V为提取液体积；ε为矢车菊-3-O-葡萄糖苷的消光系数26 900；L为光程1 cm；m为蓝莓酒渣质量1 g。

1.3.3 花青素组成分析

参照文献[14]中所述方法分析花青素组成。

1.4 数据分析和处理

所有数据均使用Excel 2019 和SPSS 22 软件进行计算和分析，单因素结果均使用Origin 2018软件绘图，使用Design-Expert 8.0.5 软件进行响应面试验设计与结果分析。

2 结果与分析

2.1 蓝莓酒渣花青素提取单因素试验

2.1.1 乙醇体积分数对提取效率的影响

乙醇体积分数对蓝莓酒渣花青素提取效率的影响如图1所示。从图1 可以看出，乙醇体积分数对蓝莓酒渣花青素的提取效率有较大影响，体积分数为60%的乙醇溶液对蓝莓酒渣花青素有较好的提取效果，乙醇体积分数增加或降低时花青素提取效率均出现了不同程度降低。这是因为花青素属于黄酮类化合物，分子极性较强，易溶于极性与之类似的溶剂，不同体积分数乙醇的极性不同，当乙醇溶液极性与花青素极性相近时，花青素提取效率较高。

图1 不同乙醇体积分数条件下蓝莓酒渣花青素的提取效率Fig.1 Extraction efficiency of anthocyanins from blueberry lees with different ethanol volume fractions

2.1.2 提取温度对提取效率的影响

提取温度对蓝莓酒渣花青素提取效率的影响如图2所示。从图2 可以看出，蓝莓酒渣花青素提取效率随温度升高呈现先升高、后降低的趋势，当提取温度由30 ℃升至50 ℃时，由于分子运动加快，花青素向溶剂扩散的速度加快，因此提取效率有所提高，但当温度继续升高时花青素发生热分解而导致提取效率下降，尤其是当温度超过70 ℃时提取效率下降明显，因此蓝莓酒渣花青素提取的最佳温度为50 ℃。

图2 不同提取温度条件下蓝莓酒渣花青素的提取效率Fig.2 Extraction efficiency of anthocyanins from blueberry lees with different extraction temperature

2.1.3 料液比对提取效率的影响

料液比对蓝莓酒渣花青素提取效率的影响如图3所示。从图3 可以看出，在一定范围内，蓝莓酒渣花青素提取效率随着溶剂比例的增多而升高，当料液比为1∶20 时提取效率达到最高，随溶剂比例继续增加，提取效率出现了显著下降，因此蓝莓酒渣花青素提取的最佳料液比为1∶20。

图3 不同料液比条件下蓝莓酒渣花青素的提取效率Fig.3 Extraction efficiency of anthocyanins from blueberry lees with different solid-liquid ratios

2.1.4 溶剂pH 对提取效率的影响

溶剂pH 对蓝莓酒渣花青素提取效率的影响如图4所示。从图4 可以看出，溶剂pH 较低时更有利于蓝莓酒渣花青素的提取，当溶剂pH 为2 或3 时，蓝莓酒渣花青素提取效率无显著差异，但当pH 为4时，蓝莓酒渣花青素提取效率出现显著降低，因此蓝莓酒渣花青素提取的最佳溶剂pH 为2 或3。

图4 不同溶剂pH 条件下蓝莓酒渣花青素的提取效率Fig.4 Extraction efficiency of anthocyanins from blueberry lees with different solvent pH

2.1.5 提取时长对提取效率的影响

提取时长对蓝莓酒渣花青素提取效率的影响如图5所示。从图5 可以看出，蓝莓酒渣花青素提取效率随提取时长的延长出现先增后降的趋势，当提取时长为1.5 h 时花青素提取效率出现最高点。这是因为花青素提取的动力主要来源于物料与溶剂中花青素的浓度差，提取时长较长时花青素的溶解更充分，花青素提取效率更高，但随着提取时长继续延长花青素发生降解，从而导致提取效率有所降低。

图5 不同提取时长条件下蓝莓酒渣花青素的提取效率Fig.5 Extraction efficiency of anthocyanins from blueberry lees with different extraction duration

2.2 蓝莓酒渣花青素提取响应面试验

2.2.1 响应面试验设计

以单因素试验为基础，选择乙醇体积分数、提取温度、料液比、提取时长和溶剂pH 共5个因素，进行5 因素3 水平Box-Behnken 响应面中心组合设计试验，因素和水平编码见表1。

在该“囚徒困境”式的博弈[12]中，港口城市可采取的最优投资策略是：不会考虑竞争者的投资，认为投资越多越好，直到投资到自身投资的上限。另外一种做法是，在没有满足自身投资准则时不投资。此时，港口城市可选择的战略不投资港口、以最大能力投资港口、在口投资回报率等于城市平均投资回报率之前投资港口等3种。

表1 蓝莓酒渣花青素提取Box-Behnken 响应面试验因素及其水平Table 1 Factors and levels of Box-Behnken response surface test for anthocyanin extraction from blueberry lees

2.2.2 建模及方差分析

响应面试验结果见表2。对表2 中蓝莓酒渣花青素质量分数（ω）和5个因素进行分析，得到花青素质量分数和各因素的多元回归方程：

表2 蓝莓酒渣花青素提取Box-behnken 响应面试验结果Table 2 Box-behnken response surface experiment results of anthocyanin extraction from blueberry lees

ω=5.72+0.12A-0.15B+0.27C-0.087D-0.18E-0.040AB+0.14AC+0.012AD-0.12AE+0.062BC+0.060BD-0.15BE+0.17CD-0.058CE+0.28DE-0.16A2-0.50B2-1.98C2+0.051D2-0.018 7E2。

式中：A为溶剂体积分数；B为提取温度；C为料液比；D为溶剂pH；E为提取时长。

Box-behnken 响应面试验结果的方差分析结果见表3。由表3 可知，B、C、E、DE（溶剂pH 与提取时长的交互作用）、B2和C2对蓝莓酒渣花青素的提取效率有显著影响。从F值来看，各提取参数对蓝莓酒渣花青素提取效率的影响程度由强到弱依次为料液比、提取时长、提取温度、溶剂体积分数、溶剂pH。模型F值为33.53，且P值小于0.05，说明用该模型模拟各参数对蓝莓酒渣花青素提取效率的影响是可靠的。除此之外，该模型失拟项F值为3.18（＞0.05），说明失拟项相对于纯误差不显著，该多元回归方程对试验结果的拟合效果较好。

表3 蓝莓酒渣花青素提取Box-behnken 响应面试验结果的方差分析结果†Table 3 Variance analysis of Box-behnken response surface test results for anthocyanin extraction from blueberry lees

2.2.3 交互作用分析与工艺优化

对5个因素之间的交互作用进行分析，得出以提取液中花青素质量分数为响应值的响应面，如图6所示。从图6 可以看出，其他因素不变时乙醇体积分数升高会在一定程度上提高花青素的提取效率，提取液中花青素的质量分数会随提取温度升高出现先升、后降的趋势，料液比对提取液中花青素的含量有较大影响，其他因素不变时溶剂pH 对提取液中花青素质量分数的影响不大，其他因素不变时提取时长对提取液中花青素质量分数的影响较小。在各因素的交互作用下均存在最大响应值，说明各因素均存在最适值，以试验值最低点为出发点，以响应值为最大值进行优化，最终得到蓝莓酒渣花青素提取的最佳工艺条件：乙醇体积分数70%、提取温度50 ℃、料液比1∶20、溶剂pH=2、提取时长1 h，该条件下提取液中花青素的质量分数可达6.38 mg/g。

图6 蓝莓酒渣花青素提取效率对因素交互作用的响应面Fig.6 Response diagram of the interaction of factors on the extraction efficiency of anthocyanins from blueberry lees

2.2.4 响应面试验结果验证

经响应面试验优化后，蓝莓酒渣花青素提取的最佳工艺条件确定为乙醇体积分数70%、料液比1∶20、乙醇溶液pH=2、提取温度50 ℃、提取时长1 h，在此条件下蓝莓酒渣花青素提取液中花青素的质量分数为6.38 mg/g。为了验证经优化后蓝莓酒渣花青素提取工艺的可靠性，在此工艺条件下进行3 次提取试验，蓝莓酒渣花青素提取液中花青素的质量分数为(6.17±0.02)mg/g，与理论值6.38 mg/g 基本吻合，说明响应面优化结果准确可靠。

2.3 蓝莓酒渣花青素组成分析

蓝莓酒渣、鲜果和3 种花青素标准品的高效液相色谱分析结果如图7所示。从图7 可以看出，3 种标准品的出峰顺序依次为飞燕草色素（10.396 min）、矢车菊色素（13.091 min）、锦葵色素（17.333 min），对照标准品可知蓝莓酒渣提取液中共有2 种花青素，分别为飞燕草色素和锦葵色素，蓝莓鲜果中除了含有3 种有标样的花青素之外还含有1 种无标样的花青素，根据文献报道推测该花青素可能为矮牵牛色素[14]。

图7 蓝莓酒渣和鲜果花青素提取液及花青素标准品的高效液相色谱分析结果Fig.7 HPLC analysis of extracts from blueberry lees and fresh fruits and standard anthocyanins

蓝莓发酵前后花青素组成和含量变化较明显。其中，蓝莓酒渣中所含2 种花青素燕草色素和锦葵色素的相对含量分别为70.48%和29.52%，蓝莓鲜果中飞燕草色素、矢车菊色素、无标样物质和锦葵色素的相对含量分别为16.92%、11.08%、16.83%和55.17%。发酵后，蓝莓中飞燕草色素的峰面积由82.3 变为78.3，变化较小；矢车菊色素和无标样物质峰面积分别由53.9 和81.9 变为0，变化明显；锦葵色素峰面积由268.4 变为32.8，变化较大。由此可见，蓝莓经过发酵后4 种花青素的含量均有不同程度减少，其中矢车菊色素、无标样物质和锦葵色素减少程度最大，飞燕草色素减少程度最低。

3 结论与讨论

本研究中使用柠檬酸酸化的乙醇溶液提取蓝莓酒渣中的花青素，经采用响应面法优化后确定了最佳工艺条件：乙醇体积分数70%、提取温度50℃、料液比1∶20、溶剂pH 为2、提取时长1 h。验证试验结果显示，在该提取条件下，提取液中花青素的质量分数可达(6.17±0.02)mg/g，与预测值6.38 mg/g 仅相差3.29%，表明响应面优化结果准确可靠。蓝莓发酵后，所含花青素种类和含量均有较大的变化，‘灿烂’蓝莓鲜果中主要含有飞燕草色素、矢车菊色素、锦葵色素和一种未知色素，4 种色素的相对含量分别为16.92%、11.08%、55.17%和16.83%，蓝莓酒渣中仅含有飞燕草色素（70.47%）和锦葵色素（29.53%）。

乙醇体积分数、溶剂pH、提取温度、料液比和提取时长均对蓝莓酒渣花青素的提取效率有较大的影响。单因素试验结果显示，乙醇体积分数为60%时蓝莓酒渣花青素提取效果较好。前人的研究结果也表明：乙醇浓度对花青素的提取效率有较大影响，蓝莓花青素提取较理想的乙醇体积分数为50%～70%[15,20]；在花青素提取过程中溶剂pH 越低，花青素提取效果越好，这可能与花青素在酸性条件下更稳定有关[21-22]。李亮等[23]和张盼盼等[24]的研究结果表明，溶剂pH 为2 或3 时有更高的花青素提取效率，胡敏等[25]的研究结果也表明当溶剂pH 为2 时更有利于花青素的提取和保存。提取时长对花青素提取效率有显著影响，提取时长过短则花青素溶出不充分，提取时长过长会导致花青素严重分解，前人的研究结果也说明了这一现象[26-27]。在本研究中提取时长为1.5 h 时，既能保证花青素充分溶出，又能保证花青素分解程度较低，因此1.5 h 是较理想的提取时长。花青素具有热分解的特点，且其分解过程为一级反应动力学过程[28-29]，因此提取温度不宜过高，但是在实际操作中往往会根据试验材料中花青素溶出的难易程度调整提取温度[30]。蓝莓酒渣花青素溶出速度较快，本研究中得出的最佳提取温度与杨玉等[31]的研究结果较接近。在提取过程中，料液比是决定提取效率的重要因素之一，料液比过低导致提取达到平衡的时长过短，目标成分溶解不充分，料液比过高则会导致溶剂的浪费，因此在提取过程中选择合适的料液比是至关重要的。料液比对蓝莓加工残渣中花青素的提取有较大的影响，在本研究中得出的蓝莓酒渣花青素提取的最佳料液比为1∶20，与田建华等[32]的研究结果类似。响应面试验结果表明，蓝莓酒渣花青素的提取效率不仅取决于各因素，还在一定程度上取决于各因素之间的交互作用，其中溶剂pH 与提取时长的交互作用对花青素提取效率的影响最显著，与张盼盼等[24]的研究结果存在一定差异，这可能是原材料、提取方式等不同导致的。

蓝莓在发酵后4 种花青素的含量均有不同程度减少，其中锦葵色素含量变化较大，矢车菊色素和未知色素含量变化明显，飞燕草色素含量变化较微弱，蓝莓酒渣中仅检测出2 种花青素，其中飞燕草色素相对含量为70.48%，锦葵色素相对含量为29.52%。宋颀等[33]和Wu 等[34]的研究结果表明，蓝莓酒渣中锦葵色素是含量最高的花青素，与本研究结果有一定差异，这可能是因为蓝莓品种和发酵条件存在差别，丁原春等[35]的研究结果表明蓝莓在发酵过程中花青素含量的变化受发酵工艺的影响较大。

由于受发酵条件影响，蓝莓酒渣中残留的花青素种类和含量有较大差异，而本研究中仅考虑了在实验室条件下蓝莓酒渣中花青素的组成，应进一步探索工业化生产过程中产生的蓝莓酒渣中花青素的高值化利用，因此下阶段将围绕花青素的精制、各种花青素的分离提纯、各种花青素之间的协同规律以及花青素在功能性食品加工过程中的应用等方面开展研究。