李梦莎，周 琳，王 化，朱良玉，何丹娆，周丽萍

（黑龙江省科学院 自然与生态研究所，黑龙江 哈尔滨 150040）

蓝靛果Lonicera caeruleaL.是忍冬科忍冬属蓝果忍冬的变种，为落叶灌木，又称为羊奶子果、山茄子果、黑瞎子果等[1-3]。蓝靛果浆果（新鲜或者冷藏）被审定为新型食品。蓝靛果具有能抵抗寒冷、虫害和土壤酸化的特点。其在波兰、斯洛文尼亚、捷克共和国和斯洛伐克等欧洲国家和中国的东北地区、内蒙古、河北、山西、宁夏都有广泛的种植[4-6]。近几年，有关蓝靛果的研究内容主要集中于抗癌、抗炎、抗氧化活性等方面[5-8]。蓝靛果的这些保健功用与其果实中含有的花色苷类、黄酮类、多酚类等植物化学成分有关，而蓝靛果中植物化合物的含量和功能特性与品种、基因型和采收地点均密切相关[9-10]。

目前，如何从食物源中寻找抗氧化活性强的物质已成为相关研究的重要主题，因为含有抗氧化剂的浆果对癌症、肿瘤和炎症性疾病具有很强的抑制功效[11-13]。而有关研究结果表明，蓝靛果浆果是自由基清除剂的优质来源物；Halvorsen 等[14]研究认为，黑莓、草莓、覆盆子和蓝莓都是抗氧化能力极强的浆果；Rupasinghe 等[15]在一项体外试验中证明，蓝靛果的抗氧化活性通常比草莓、蓝莓或黑莓的更强。在酚类化合物中，花色苷作为抗氧化剂，能够有效减轻紫外线辐射、糖尿病和神经退行性疾病带来的负面影响，且对肝脏和心脏具有保护作用。此外，Zhao 等[16]的研究结果表明，抗氧化活性与生物活性化合物的提取方式密切相关，甲醇提取物比乙酸乙酯或二氯甲烷提取物具有更强的抗氧化活性。目前，国内外关于蓝莓、笃斯越桔、蔓越莓等浆果中的花色苷的研究报道很多，但是，关于蓝靛果中花色苷抗氧化活性的研究报道却较少[17-18]。‘蓝精灵’Lonicera caerulea是新近培育出的蓝靛果品种，近几年其栽培面积不断扩大，已形成规模化的生产格局，对其分离纯化及生理功能展开研究，可为花色苷产品的深加工与高值化利用提供理论参考依据，以推动其产业的快速发展[19-22]。为此，本研究以蓝靛果为原料，对色谱柱层析分离纯化蓝靛果花色苷的工艺条件进行研究，并对分离纯化前后不同花色苷组分抗氧化活性进行比较分析，以期获得纯度较高、抗氧化活性较强的花色苷类化合物，为蓝靛果资源的进一步开发利用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材 料

供试原料为采摘于哈尔滨市宾县河西村浩北蓝莓基地的蓝靛果栽培品种‘蓝精灵’的成熟果实。

1.2 方 法

1.2.1 样品的制备

参照有关文献[23]中介绍的方法制备花色苷的提取物，以体积分数为70%的乙醇作为提取剂，采用超声辅助的方法进行提取。

1.2.2 花色苷含量的测定

采用高效液相色谱法测定提取物和纯化后蓝靛果各组分中的花色苷，以矢车菊-3-O 葡萄糖苷为标准品，建立标准曲线进行测定。

1.2.3 固定相介质的选择

从XDA 系列和LX 系列树脂中选用适用于多酚类物质分离的XDA-7、XDA-4、LX-28 和LX-17 这4 种类型的树脂，各种树脂的物理参数详见表1，并对各种树脂进行活化处理。

表1 4 种类型大孔吸附树脂的物理参数Table 1 Physical parameters of four types of macroporous resins

1.2.4 静态吸附与解析试验设计

分别称取已活化好的4 种树脂，每种树脂各10.00 g，将其分别置于150 mL 的具塞锥形瓶中，然后分别加入在525 nm 处其吸光值（A）为1.000的蓝靛果花色苷样品液100 mL。将锥形瓶放入恒温振荡器中，于室温、转速为100 r·min-1的条件下振荡吸附。在振荡开始后，每间隔0.5 h 量取2.5 mL 的花色苷样品液，在525 nm 下测定吸光值（A0），直至树脂颗粒达到吸附饱和状态、加入的蓝靛果花色苷提取溶液在525 nm 处的吸光值（A1）保持不再下降为止。然后滤除瓶中花色苷液体，再加入70%的乙醇水溶液100 mL 进行解析试验；在解析开始后，每间隔0.5 h 量取花色苷样品液2.5 mL，在525 nm 下测定吸光值（A2），直至吸光值无显著增加为止，这才完成静态解析试验。吸附率（adsorption rate，Ra）和解析率（resolution rate，Rr）的计算公式分别如下：

上列2个公式中：Ra表示吸附率，Rr表示解析率；A0表示花色苷原液的吸光值，A1表示吸附后滤液的吸光值，A2表示解析后滤液吸光值；V0表示花色苷原液的体积，V1表示吸附后滤液的体积，V2表示解析后滤液的体积。

1.2.5 动态洗脱试验设计

将选出的比较好的树脂进行动态洗脱试验。采用湿法装柱，柱高30 cm，直径1 cm，将树脂装至20 cm 高处后静置24 h 进行平衡，然后加入质量浓度为25 µg·mL-1的花色苷提取液3.0 mL，静止吸附2 h 后，先用3 BV 的蒸馏水洗脱，然后用3 BV 的70%乙醇洗脱，收集乙醇洗脱液，收集3 mL 为1 管，在525 nm 处测定吸光值，绘制动态洗脱曲线。

1.2.6 流动相优化试验设计

参照前述装柱方法，以乙醇水溶液为洗脱剂，从其浓度为40%开始洗脱，以10%为一个浓度梯度值，待其浓度为90%时收集洗脱液，研究不同浓度乙醇的洗脱效果。

1.2.7 抗氧化指标的测定方法

参照试剂盒上的方法和步骤测定总抗氧化能力；参照有关文献[24]中介绍的方法测定蓝靛果花色苷对羟自由基的清除能力；按照包怡红等[25]采用的方法测定蓝靛果花色苷对DPPH 自由基的清除能力。将纯化前后的样品溶液稀释至相同浓度进行测定。

1.2.8 数据分析

使用IBM SPSS Statistics（Version 19）软件进行数据统计与分析，使用Excel 软件进行分析与作图。

2 结果与分析

2.1 静态吸附和解析结果

4 种类型大孔树脂对蓝靛果花色苷的吸附率与解析率的测定结果见表2。由表2 可知，XDA-7与LX-28 型大孔树脂对蓝靛果花色苷的吸附率均较高，分别达到83.52%和76.31%；XDA-7 与LX-28 型大孔树脂对蓝靛果花色苷的解析率也都较高，都可达到75%以上。XDA-7 型大孔树脂对蓝靛果花色苷的吸附率、解析率分别为83.52%、85.35%，均为最高值，且其差异均有统计学意义（P＜0.01）。这一测定结果说明，XDA-7 型大孔树脂为纯化蓝靛果的最佳树脂。

表2 4 种类型大孔树脂的吸附率与解析率Table 2 Adsorption rate and desorption rate of four types of macroporous resin %

2.2 动态洗脱结果

花色苷的静态吸附曲线如图1所示。由图1可知，XDA-7 型大孔树脂在吸附30 min 后基本达到吸附平衡。花色苷的解析曲线如图2所示。由图2 可知，乙醇溶液对XDA-7 型介质有较好的解析能力，解析90 min 基本达到解析平衡。绘制的花色苷动态洗脱曲线如图3所示。由图3 可知，以70%的乙醇为洗脱剂进行洗脱，当洗脱体积为15 mL 时，可以获得较纯的蓝靛果花色苷解析液；而当洗脱液体积大于15 mL 后，花色苷的质量浓度开始下降。这一测定结果说明，15 mL 为最适的洗脱液体积。

图1 花色苷的静态吸附曲线Fig.1 Static adsorption curve of the anthocyanin

图2 花色苷的解析曲线Fig.2 Analytical curve of anthocyanin

图3 固定相介质对花色苷的动态洗脱图Fig.3 Dynamic elution figure of the stationary phase medium for the anthocyanin

2.3 流动相介质优化研究结果

分别选取40%、50%、60%、70%、80% 和90%的乙醇水溶液作为流动相介质，对已饱和吸附花色苷的XDA-7 型大孔树脂介质进行解析，计算解析率，结果如图4所示。由图4 可知，当乙醇的体积分数达到70%时，花色苷的解析率已达到82.5%；再继续增加乙醇的体积分数，其解析率与前者的差异并不大。因此，结合经济成本分析确定，最佳流动相介质为70%的乙醇水溶液。

图4 流动相介质的洗脱效果Fig.4 Elution effect of mobile phase medium

2.4 纯化后花色苷的纯度分析结果

经过优化纯化条件对蓝靛果花色苷粗提物进行洗脱与纯化，结果得到了蓝靛果花色苷的4个组分，根据洗脱顺序，将其分别命名为L1、L2、L3、L4，而将其粗提物命名为L0，花色苷各组分的纯度如图5所示。由图5 可知，花色苷4个组分的纯度均在20%以上，其中，L2组分的纯度最高，达到了（45.91%±0.32%），与粗提物L0 的纯度（7.64%±0.26%）相比，L2 组分的纯度提高了6 倍。各组分的纯度由大到小依次为L2 ＞L3 ＞L1 ＞L4 ＞L0。

图5 花色苷不同组分的纯度Fig.5 The purity of anthocyanins in different components

2.5 蓝靛果花色苷体外抗氧化能力的测定结果

2.5.1 蓝靛果花色苷总抗氧化能力

蓝靛果中含有多种生物活性物质，其有较强的体外抗氧化活性。一般情况下，总抗氧化能力表示待测样品中所有抗氧化剂的抗氧化能力之和。蓝靛果花色苷果实中的总抗氧化能力的测定结果如图6所示。由图6 可知，纯化后蓝靛果中花色苷各组分的总抗氧化能力均高于其粗提物的，说明纯化有利于增强待测样品的抗氧化能力。抗氧化剂常分为阻止型抗氧化剂和断链型抗氧化剂，植物体内存在的花色苷类物质一般属于断链型抗氧化剂，通过释放活泼氢与自由基或氢离子或电子结合，转化为稳定的非自由基产物。纯化后，由于极性的不同，除去了花色苷组分中的糖、蛋白质等成分，使得花色苷等抗氧化组分的含量有所增加，从而增强了其抗氧化能力。纯化后花色苷不同组分的总抗氧化能力不同，这可能与不同组分花色苷的结构不同有直接关系。花色苷4 种组分的纯化产物的总抗氧化能力随着花色苷质量浓度的增大而增强。其中，花色苷L2 组分的总抗氧化能力最强，当花色苷的质量浓度达到0.1 mg·mL-1时，其总抗氧化能力为5.77 U·mL-1，花色苷L3、L1、L4 组分的总抗氧化能力依次次之。

图6 蓝靛果花色苷各组分的总抗氧化能力Fig.6 Total antioxidant capacity of each component of L.caerulea anthocyanins

2.5.2 蓝靛果花色苷清除羟自由基的能力

蓝靛果花色苷各组分清除羟自由基能力的检测结果如图7所示。由图7 可知，随着蓝靛果花色苷各纯化组分质量浓度的增大，花色苷大部分组分清除羟自由基的能力均增强。这一结果说明，蓝靛果花色苷各纯化组分的质量浓度与其清除羟自由基能力之间呈现量效关系。清除羟自由基能力最强的是L2 组分，当其质量浓度为0.8 mg·mL-1时，其对羟自由基的清除率达到93%；其次是L1 组分的，其清除率达到91%；L3 和L4组分对羟自由基的清除率分别为80%与76%。

图7 蓝靛果花色苷各组分清除羟自由基能力的比较Fig.7 Comparison of scavenging ability of anthocyanins from L.caerulea to hydroxyl free radicals

2.5.3 蓝靛果花色苷清除DPPH 自由基的能力

蓝靛果花色苷清除DPPH 自由基能力的测定结果如图8所示。由图8 可知，当花色苷的质量浓度为0.2 ～0.8 mg·mL-1时，蓝靛果花色苷清除DPPH 自由基的能力随其质量浓度的增加而增强。这一结果说明，花色苷的质量浓度与其清除羟自由基能力之间呈现量效关系。而当其质量浓度大于0.8 mg·mL-1时，花色苷L3、L4 组分清除DPPH 自由基的能力反而减弱。这一结果说明，花色苷的质量浓度与其清除羟自由基能力之间存在一个动态平衡的状态和量效的关系。

图8 蓝靛果花色苷不同组分清除DPPH 自由基能力的比较Fig.8 Comparison of scavenging ability of anthocyanins from L.caerulea to DPPH

2.5.4 蓝靛果花色苷不同组分清除自由基能力的比较分析

半数抑制浓度即IC50值可以反映抗氧化剂对自由基的清除能力，IC50值越小，表明抗氧化剂的抗氧化能力越强。计算IC50值（指自由基抑制率达到50%时花色苷的质量浓度），比较分析不同抗氧化剂的IC50值的大小，有利于比较分析其抗氧化能力的强弱。蓝靛果花色苷不同组分清除羟自由基、DPPH 自由基的IC50值的测定结果见表3。由表3 可知，蓝靛果花色苷L2 组分清除羟自由基的IC50值最小，为0.358 mg·mL-1；而其粗提物L0 清除羟自由基的IC50值最大，为0.715 mg·mL-1；不同组分清除羟自由基的IC50值从小到大的顺序为L2 ＜L1 ＜L4 ＜L3 ＜L0。蓝靛果花色苷L4 组分清除DPPH 自由基的IC50值最小，为0.510 mg·mL-1；而其粗提物L0 清除DPPH自由基的IC50值最大，为0.726 mg·mL-1；不同组分清除DPPH 自由基的IC50值从小到大的顺序为L4 ＜L2 ＜L3 ＜L1 ＜L0。

表3 蓝靛果花色苷不同组分清除羟自由基、DPPH 自由基的IC50 值Table 3 IC50 value of hydroxyl free radicals and DPPH scavenging activity by anthocyanins in L.caerulea mg·mL-1

2.6 花色苷的纯度与其体外抗氧化能力间的相关性分析

花色苷的纯度与其体外抗氧化能力间的相关系数见表3。由表3 可知，花色苷的纯度与其总抗氧化能力间呈显著正相关；而与其清除羟自由基、DPPH 自由基的IC50值之间均呈负相关，但其相关性均不显著（P＜0.05）。

表3 花色苷的纯度与其总抗氧化能力、清除羟自由基和DPPH 自由基能力间的相关性分析结果Table 3 Correlation analysis between anthocyanin purity and total antioxidant capacity,scavenging ability of hydroxyl radicals and DPPH

蓝靛果花色苷的纯度与其各抗氧化指标之间的相关性分析结果如图9所示。因为羟自由基清除率与IC50值之间呈负相关关系，因此可以得出，随着花色苷纯度的逐渐增加，其清除自由基的能力逐渐降低。花色苷的总抗氧化能力与其含量的线性关系方程中的R2值最高，为0.868，表明两者间具有一定的相关性，这说明花色苷的总抗氧化能力随着花色苷纯度的增加而增加，因此花色苷的纯度可以用作花色苷总抗氧化能力评价的参考指标。

图9 花色苷的纯度与各抗氧化指标之间的相关性分析结果Fig.9 Correlation between anthocyanin purity and each antioxidant indexes

3 结论与讨论

本研究采用大孔吸附树脂提取并纯化蓝靛果中的花色苷，根据4 种大孔树脂的含水率、吸附率、解析率的测定结果，筛选出的效果最优的大孔树脂为XDA-7 型树脂；动态吸附和解析试验结果均表明，XDA-7 型树脂在吸附30 min 时达到平衡状态；XDA-7 型树脂在解析90 min 时达到平衡状态；3 BV 为XDA-7 型树脂最适的洗脱体积。纯化后蓝靛果各组分的抗氧化活性均优于其纯化前的；纯化后蓝靛果各组分的总抗氧化能力随着其质量浓度的增大均增强，其中，L2 组分的最强，且其总抗氧化能力与其质量浓度之间呈现出良好的线性关系；清除羟自由基能力最强的组分是L2组分，当其质量浓度达到0.8 mg·mL-1时，其对羟自由基的清除率达到93%；而其清除DPPH 自由基的IC50值，L2 组分的为0.531 mg·mL-1，L4 组分的为0.510 mg·mL-1，前者略低于后者。研究结果表明，纯化可以大大增强花色苷的抗氧化能力，其中L2 组分的综合抗氧化能力最强，这一结果可为后续的深入研究提供参考依据。

花色苷的纯化，主要采用大孔树脂柱层析法进行。近几年，常用的蓝浆果花色苷纯化树脂类型分别有X-5 与AB-8 型。本研究筛选出了一种可适用于花色苷分离与纯化的XDA-7 新型树脂，其吸附率与解析率分别达到83.5%和85.3%。其吸附率与解析率均高的原因可能是，花色苷分子结构中含有极性糖基和非极性母核，总体显示出弱极性，而XDA-7 型树脂亦为弱极性，因此其吸附率与解析率均高。

花色苷属于生物类黄酮物质，而黄酮物质最主要的生理活性功能是自由基清除能力和抗氧化能力。因此，花色苷整体纯度越高，则有可能具有越高的抗氧化能力。本研究采用目前最常用的总抗氧化能力、清除DPPH 自由基能力、清除羟自由基能力等3 种评价指标，分析评价了纯化后不同组分的抗氧化活性，结果表明，花色苷纯化产物的质量浓度与其抗氧化能力之间呈现正相关性，这一分析结果证明了纯化产物中的物质大部分为具有抗氧化活性的黄酮类物质。此外，纯化产物的纯度与其抗氧化活性之间也呈正相关，说明以这3 种指标评价其抗氧化能力具有协同性与相似性，也进一步验证了结果的可靠性，这与有关研究者对其他小浆果[26]的研究结果一致。据此可根据黄酮含量的高低初步判定其种质中抗氧化活性的强弱。但是，纯化产物的纯度虽然与其清除羟自由基、DPPH 自由基的IC50值之间均呈现负相关性，可其相关性均不显著。因此说明，除纯度外，花色苷的结构对于其抗氧化能力同样具有决定作用，所以如何进一步鉴定纯化产物中花色苷的结构是后续相关研究中亟待解决的问题。胥萍等[27]的研究结果表明，D101 型大孔树脂对血橙中的花色苷具有良好的吸附与解析能力，其对DPPH 自由基和ABTS 自由基都有一定的清除作用，且其作用随其质量浓度的增加而增强；包智影等[28]研究了以微生物法提取黄精多糖的工艺条件。这些研究结果与本研究结果均相似。

综上所述，采用XDA-7 型树脂纯化蓝靛果提取物，可以得到较高纯度的花色苷，同时能获得具有抗氧化活性强的花色苷组分和生物活性物质。这一研究结果可为我们从经济林中获取高价值的除木材以外的生物产品及经济林产品的高值化利用[29]奠定理论基础。但是，本研究仅采用初步纯化方法进行试验，在后续的相关研究中，可进一步对筛选出的L2 组分进行二次纯化与结构鉴定，以获得纯度更高、品质更优的花色苷产品。