邵文达，吴可心，任艳君，刘昱利，孙菲阳，唐中华

（东北林业大学 a.化学化工与资源利用学院；b.林学院，黑龙江 哈尔滨 150040）

短梗五加Eleutherococcus sessiliflorus，又称无梗五加，民间俗称“乌鸦子”，是五加科Araliaceae五加属Eleutherococcus药用植物，属多年生落叶灌木或小乔木，常丛生或散生于针阔叶混交林或阔叶林中。短梗五加主要分布于我国的东北、内蒙古、河北、山西地区及朝鲜、俄罗斯远东地区[1]。由短梗五加的根、茎、叶、果等部位提取分离出的活性成分含量及其相关功能各不相同。短梗五加的根、茎中富含黄酮类、木脂素类活性成分，其根皮俗称“五加皮”，为民间常见中药，性温，味辛、苦，归肝、肾经，具有抗疲劳、抗癌、保肝护肝、消炎、安神等功效[2]。短梗五加叶、果中的挥发油、有机酸类、色素等活性成分则被广泛应用于医药及食品深加工领域[3]。短梗五加果被原国家卫生部列为食品新资源，是一种药食同源食品，含有黄酮、多糖、维生素、矿物质、必需氨基酸、花青素等成分。短梗五加果实性温，无毒，具有抗炎、镇痛、抗肿瘤、保肝[4-5]、改善睡眠、降血脂、预防心血管疾病[6]、平衡阴阳、补肾强腰等多种功效，是新型保健食品的优质原料[7]。短梗五加的嫩茎俗称“刺拐棒”或“绿参”，其嫩茎叶常被作为山野菜。

与同科属其他植物相比，短梗五加的特定部位还含有一些特色功能性成分，这些活性成分的分离、鉴定及药理分析对该科属植物的深入研究具有重要的参考价值[8-9]。短梗五加果实中富含的活性物质有金丝桃苷、刺五加苷B、刺五加苷E、齐墩果酸、异嗪皮啶等。金丝桃苷是短梗五加等五加属植物中的重要活性物质，具有降血糖、降血脂[10]、镇静、抗抑郁[11]等药用功效，同时还具有一定的抗癌作用[12]。刺五加苷为五加属植物中含量较为丰富的特异性成分，主要有刺五加苷B（紫丁香苷）、刺五加苷E 等，具有强效的缓解身心疲劳的作用[13]。相关研究结果证明，刺五加苷B具有一定的消炎、镇痛、保肝护肝、抗肿瘤等功效[14-17]，刺五加苷E 具有预防细胞脂质聚积[18]、促进睡眠、镇静安神等功效。齐墩果酸具有一定的抗血栓、抗血小板凝集活性[19]，而且其因具有良好的抗氧化性及保肝护肝功效在食品、医疗领域日益受到关注。异嗪皮啶具有镇静、抗肿瘤及抗氧化等功效[20-21]。

果实中糖和有机酸等代谢组分及其含量水平是果实品质的重要影响因素。在果实生长发育过程中，糖及其活化形式为果实多种代谢过程提供底物、中间反应物和能量等，形成果实风味等[22-23]，糖还为果实细胞膨大提供渗透推动力[24-25]。有机酸通常在果实生长过程中积累，在果实成熟过程中作为糖酵解、三羧酸循环等呼吸基质（ATP 来源）以及糖异生作用基质而被消耗[26]。了解短梗五加果实类型，研究短梗五加果实发育过程中的糖和酸代谢及其变化规律，对于研究提高短梗五加的果实品质具有重要意义。

20世纪90年代，代谢组学作为一门全新学科逐渐发展起来[27]。近年来，代谢组学发展十分迅速，目前已经成为植物生物学研究的一个重要领域[28]。植物代谢组学主要采用4 种分析技术：核磁共振谱、毛细管电泳色谱质谱联用、气相色谱质谱联用[29]和液相色谱质谱联用[30]。目前，代谢组学分析在果实生物学研究中被广泛应用，例如，在枇杷[31]、蓝莓[32]、莲雾[33]、脐橙[34]等果实发育成熟过程中代谢过程及所参与化合物等的变化的研究中得以应用。目前，对短梗五加根、茎、叶的研究报道颇多，但对其果实的生长形成以及发育成熟代谢的研究报道较为鲜见。文中以短梗五加果实为研究对象，利用液相色谱-质谱联用技术、气相色谱-质谱联用技术对不同时期短梗五加果实代谢产物进行分析，并对5个时期的差异代谢物进行了筛选，旨在为提高短梗五加果实品质提供参考，为短梗五加果实资源的合理利用及相关产品的高效开发提供思路。

1 材料与方法

1.1 材 料

以东北林业大学化学化工与资源利用学院（126°37′47.24″E，45°44′1.61″N）栽培的5年生短梗五加（约65 株）为样株。分别于2020年8月25日、8月31日、9月16日、9月22日、10月19日，在短梗五加样株的东、西、南、北方向，随机采摘无病虫害且大小基本一致的果实，混样，重复至少3 次，经液氮速冻后-80 ℃条件下保存。

1.2 样品制备

初级代谢和次级代谢样品的制备以及色谱、质谱条件参照刘洋[35]的方法，将衍生样品以液体形式注入Agilent 7890A-5975C GC-MS（gas chromatography-mass spectrometry）系统（美国安捷伦公司），以高纯氦为载气进行分离，恒定流速为1.0 mL/min，注入温度和离子源温度分别设置为260、230 ℃，模型为电子碰撞电离（−70 eV），采用全扫描模式分析初级代谢产物。采用UPLC-MS（ultra-high liquid chromatograph-mass spectrometer）分析次生代谢产物，将获得的数据进行分析和归一化处理，用峰面积的标准曲线测定化合物的含量。

1.3 数据分析

使用Agilent GC-MS 5975 数据分析软件处理数据，并使用XCMS 软件包进行数据的特征峰提取和预处理，将预处理完毕的数据矩阵归一化后导入SIMCA-P 13 软件（Umet-rics，Umea，瑞典）进行PCA 和PLS-DA 等多元统计分析，再以变量对分组贡献得分（VIP 值）大于1 和单因素方差分析结果显著（P＜0.05）为差异性代谢产物的筛选标准。将差异代谢物输入KEGG 数据库和Metabo Analyst 数据库（https://www.metaboanalyst.ca）进行代谢途径的富集和筛选。GC-MS 代谢组学和LC-MS 代谢组学数据均使用Microsoft Excel 2019和SPSS 25.0 软件进行统计分析（采用单因素方差分析法），使用GraphPad Prism 8 软件绘图。

2 结果与分析

2.1 短梗五加果实5个时期的性状

根据果实的纵横径和颜色将果实生长发育过程分为5个时期（图1），分别为幼果期（8月25日）、绿熟期（8月31日）、半转色期（9月16日）、转色期（9月22日）、成熟期（10月19日）。幼果期的果实小且硬；绿熟期的果实迅速膨大，显现出品种特有的形态，果实整体较为饱满；半转色期的果实开始有色素沉着，这个阶段的果实半青半紫；转色期的果实整体呈现均匀的色素沉着，果粒完全呈现深紫黑色，果肉开始软化；成熟期的果实一般用于制成可食用或药用的干果。

图1 5个发育时期的短梗五加果实Fig.1 Fruits of E.sessiliflorus at five developmental stages

2.2 短梗五加果实5个时期的活性物质含量

短梗五加果实5个时期的活性物质（刺五加苷B、刺五加苷E、金丝桃苷、异嗪皮啶、齐墩果酸）含量如图2所示。由图2 可见：在幼果期、绿熟期、半转色期，5 种活性成分的含量基本稳定，刺五加E质量分数为0.02 ～0.04 μg/g，刺五加苷B 质量分数为0.01 ～0.03 μg/g，金丝桃苷质量分数为0.03 μg/g，异嗪皮啶质量分数为0.003 ～0.005 μg/g，齐墩果酸质量分数为155.85 ～217.65 μg/g；但是在转色期、成熟期2个阶段，5 种活性成分的含量显著增加，刺五加苷E 质量分数最高达到23.66 μg/g，是前期的1 000 倍，刺五加苷B 质量分数最高达到1.63 μg/g，是前期的100 倍，金丝桃苷质量分数最高达到3.12 μg/g，是前期的100 倍，异嗪皮啶质量分数最高达到0.008 μg/g，是前期的2 倍，齐墩果酸质量分数最高达到347.36 μg/g，是前期的2倍，并且其含量在5 种活性成分中是最高的。

图2 短梗五加果实5个时期的活性物质含量Fig.2 Active substances in five stages of E.sessiliflorus fruit

2.3 短梗五加果实5个时期的差异代谢物

2.3.1 差异代谢物的PCA 和PLS-DA 模型分析结果

对短梗五加果实5个时期代谢物累积的差异进行PCA 分析，得分情况如图3所示。在第1 主成分中，短梗五加果实的幼果期、绿熟期、半转色期、转色期与成熟期明显分开，在第2 主成分中，幼果期、绿熟期、半转色期、成熟期与转色期明显分开。即幼果期、绿熟期、半转色期与转色期、成熟期明显分开，说明短梗五加果实5个时期代谢物的累积有明显差异。

图3 短梗五加果实5个时期差异代谢物的PCA 得分Fig.3 PCA score of E.sessiliflorus fruit in five stages

但PCA 分析是一种无监督的分析方法，不能忽略组内误差并消除与研究目的无关的随机误差。为更加准确地显示短梗五加果实5个时期代谢物累积的差异，使用有监督的PLS-DA 模型进一步进行分析，得分情况如图4所示。经PLS-DA 模型分析可知，拟合优度系数R2和Q2分别为0.775、0.920，说明PLS-DA 模型的拟合结果稳定、可靠。

图4 短梗五加果实5个时期的PLS-DA 得分Fig.4 PLS-DA score of E.sessiliflorus fruit in five stages

2.3.2 差异代谢物的名称

基于PLS-DA 分析结果，得到VIP 值大于1的化合物，再经过单因素方差分析筛选P值小于0.05 的化合物，最终得到49 种差异代谢物（表1）。由表1 可知：筛选出的差异化合物中有7 种糖，分别是D-阿拉伯糖、D-半乳糖、吡喃半乳糖、乳糖、D-核糖、葡萄糖、纤维二糖；有23 种酸，分别是苹果酸、奎宁酸、琥珀酸、柠檬酸、苯甲酸、没食子酸、哌可酸、葡萄糖酸、戊酸、L-去甲缬氨酸、2-酮-1-葡萄糖酸、丙二酸、2-丙酸、4-羟基苯甲酸、丙炔酸、亚硫酸、3-羟基苯甲酸、戊二酸、醋酸、4-乙基苯甲酸、莽草酸、2-丁烯二酸、4-氨基丁酸；有4 种醇，分别是1-环戊烷硫醇、1,2-乙二醇、肌醇、甘油；其他15 种。

表1 短梗五加果实5个时期的差异代谢物（P ＜0.05）Table 1 Different metabolites of E.sessiliflorus fruit in five stages(P ＜0.05)

2.3.3 差异代谢物相对含量的聚类分析

短梗五加果实5个时期差异代谢物相对含量的聚类分析结果如图5所示。由图5 可见，幼果期积累最多的糖有D-阿拉伯糖、吡喃半乳糖，绿熟期积累最多的糖有葡萄糖，半转色期积累最多的糖有D-核糖、D-半乳糖，成熟期积累最多的糖有吡喃半乳糖、纤维二糖、半乳糖。

图5 短梗五加果实5个时期差异代谢物相对含量的聚类分析结果Fig.5 Cluster analysis of differential metabolites in five stages of E.sessiliflorus fruit

由图5 可见，在短梗五加果实的青果期，即果实尚未完全变紫黑前，幼果期、绿熟期、半转色期聚类的化合物主要是有机酸。在转色期和成熟期有机酸含量下降，在幼果期积累较多的酸有柠檬酸、没食子酸、莽草酸、奎宁酸、葡萄糖酸、2-丁烯二酸等，在绿熟期积累较多的酸有琥珀酸、葡萄糖酸等，在半转色期积累较多的酸有奎宁酸、苹果酸、2-丁烯二酸等，在转色期积累较多的酸有戊酸、哌可酸等，在成熟期积累较多的酸有苯甲酸、2-丁烯二酸等。

2.3.4 差异代谢物的通路分析

利用KEGG 数据库找到所有差异代谢物的KEGG ID，将这些ID 输入Metabo Analyst 数据库，通过代谢富集分析，共标注到7个较为重要的代谢途径，包括半乳糖代谢、硫代谢、乙醛酸/二羧酸代谢、三羧酸循环、γ-氨基丁酸（GABA）代谢、丙氨酸/天冬氨酸/谷氨酸代谢、丙酮酸代谢，结果见表2。由表2 可知，7个代谢途径中的P值均小于0.05。半乳糖代谢途径中化合物总数是27，匹配数是5，P值小于0.01，参与的化合物有乳糖、D-半乳糖、葡萄糖、肌醇、甘油。三羧酸循环中化合物总数是20，匹配数是4，P值小于0.01，参与的化合物有柠檬酸、2-丁烯二酸、琥珀酸、苹果酸。乙醛酸/二羧酸代谢途径中化合物总数是29，匹配数是4，P值小于0.01，参与的化合物有柠檬酸、琥珀酸、醋酸、苹果酸。硫代谢途径中化合物总数是15，匹配数是3，P值小于0.01，参与的化合物有琥珀酸、醋酸、亚硫酸。丙氨酸/天冬氨酸/谷氨酸代谢途径中化合物总数是22，匹配数是3，P值小于0.01，参与的化合物有琥珀酸、2-丁烯二酸、4-氨基丁酸。丙酮酸代谢途径中化合物总数是22，匹配数是3，P值小于0.01，参与的化合物有苹果酸、2-丁烯二酸、醋酸。γ-氨基丁酸代谢途径中化合物总数是17个，匹配数是2，P值是0.05，参与的化合物有琥珀酸、4-氨基丁酸。

表2 短梗五加果实差异代谢物参与的7个代谢途径Table 2 Seven metabolic pathways involved in differential metabolites in the fruit of E.sessiliflorus

3 结论与讨论

本研究中以幼果期、绿熟期、半转色期、转色期、成熟期共5个时期的短梗五加果实为材料，基于液相色谱-质谱联用技术、气相色谱-质谱联用技术，在5个时期的短梗五加果实中鉴定出糖类、氨基酸、有机酸、醇等49 种差异化合物。研究结果表明，在果实发育前期积累了较多的糖和有机酸，随着果实发育成熟，糖分被消耗，有机酸降解并转换为糖类和氨基酸等物质。在果实发育过程中，主要参与的代谢途径有半乳糖代谢、硫代谢、乙醛酸/二羧酸代谢、三羧酸循环、γ-氨基丁酸代谢、丙氨酸/天冬氨酸/谷氨酸代谢、丙酮酸代谢等。短梗五加果实中5 种活性成分刺五加苷E、刺五加苷B、金丝桃苷、异嗪皮啶、齐墩果酸的含量在转色期、成熟期显著增加。

果实发育时期的划分一般是基于物候学信息，通过实地观测果实的大小、颜色以及成熟状态等而定。本研究中以杨楠[36]对蓝靛果实发育时期的划分为依据，根据果实发育的外部形态特点，将短梗五加果实的发育时期分为幼果期、绿熟期、半转色期、转色期、成熟期共5个时期。从其药用活性成分含量的变化和代谢物的差异来看，短梗五加果实发育时期又可以分成2个阶段：幼果期、绿熟期、半转色期为第1 阶段（青果期）；转色期、成熟期为第2 阶段。

果实中糖酸的种类、含量及其动态变化对果实风味的形成有重要的影响，是近年来果实品质研究的重要方向，如：叶丽琴等[37]探讨了欧李果实在不同发育阶段的糖酸积累规律以及不同种类糖酸间的相关性，结果表明糖酸比随果实发育呈指数函数变化趋势；安娇等[38]对软枣猕猴桃果实中的糖酸进行了研究，发现随着果实发育成熟，糖酸组分及其含量均发生了变化；魏国芹等[39]在测定甜樱桃果实糖酸组分及其含量时，发现随着果实发育，总糖含量整体呈上升趋势，总酸含量呈先增加、后下降趋势。本研究中，采用气相色谱-质谱联用技术检测了短梗五加果实发育过程中的初级代谢物，包括糖、有机酸、氨基酸、醇等，发现其中以糖酸积累为主。

在果实发育过程中，糖分可提供营养物质。蓝公毅等[40]的研究结果表明，山苍子果实在发育过程中内含物含量下降，是由于果实发育膨大过程中需要充分的营养供应，养分被消耗。在对油茶果实的研究报道中，汤佳[41]提到果实也含有叶绿素，可进行光合作用，积累糖分。本研究结果表明，短梗五加果实的糖分在前期积累，在转色期含量降低，在成熟期又增加。这可能是因为前期短梗五加叶片和果实通过同化作用产生的糖分积累在果实中，为果实生长提供了物质基础，果实在发育过程消耗养分，糖分含量降低，成熟后期，植物枝梢或根部继续向果实运输糖分，淀粉和有机酸也会转化为糖，而糖分的消耗相对较少，糖分积累下来。

果实中有机酸的组分及其含量是决定果实风味的重要指标。在果实发育期间，不同类型果实酸度的变化不同。大多数果实（如梨[42-43]、甜樱桃[39]和柚[44]等）的有机酸含量在发育前期逐步增高，随着果实成熟，有机酸含量下降。本研究结果表明，短梗五加果实中的有机酸主要为苹果酸、柠檬酸、琥珀酸、奎宁酸、没食子酸等。在前期，果实中积累了较多有机酸；随着果实生长发育有机酸含量降低；果实成熟时有机酸含量略有回升。其原因可能是果实发育初期有机酸大量合成积累，随着果实发育成熟，有机酸开始转化为糖类、氨基酸等物质，其降解大于合成，与前人的研究结果基本一致。

植物的代谢途径具有多样性，常见的代谢途径有糖酵解途径、三羧酸循环途径、磷酸戊糖途径、γ-氨基丁酸途径等。其中，γ-氨基丁酸在植物中具有多种功效，可调节植物机体pH，促进代谢和生长发育，抵御逆境等，由于功能多样，相关代谢途径的研究报道也较多[45-46]。当植物体受到逆境胁迫或植物激素作用时，植物体内GAD 酶被激活导致γ-氨基丁酸富集[47]。本研究结果表明，短梗五加果实在幼果期、绿熟期、成熟期大量积累琥珀酸和4-氨基丁酸，因此γ-氨基丁酸代谢也是此3个时期的重要代谢途径。γ-氨基丁酸代谢在这3个时期活跃，可能是因为在果实成熟过程中γ-氨基丁酸代谢促进果实成熟，而且与硫代谢共同防御外界环境的不良影响。

采收时果实发育程度对其药用成分组成及其含量具有显著影响。寿旦等[48]经研究发现，山茱萸果实由青变红直至成熟，其主要成分熊果酸、齐墩果酸含量逐渐降低至稳定状态，马钱素含量则逐渐升高，因此传统的山茱萸采收时间是合理的。本研究结果表明，在发育前期，短梗五加果实的5 种活性成分（刺五加苷B、刺五加苷E、金丝桃苷、异嗪皮啶、齐墩果酸）的含量基本稳定，在转色期、成熟期含量显著增加，这种变化规律可能与短梗五加果实生长发育过程中次生产物的消长规律及其发育变化相关，但具体原因有待进一步研究。