庞彩燕， 李广悦， 孙 静， 朱家华

(南华大学 资源环境与安全工程学院，湖南 衡阳 421001)

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 菌株购自北纳生物微生物菌种保藏中心，经上海美吉生物医药科技有限公司通过16S rDNA序列鉴定，表明该菌株与沙福芽胞杆菌(Bacillussafensis)的同源性达99%。

1.1.2 培养基 营养肉汤培养基(液体培养基)：牛肉膏3.0 g/L，氯化钠5.0 g/L，蛋白胨10.0g/L；营养肉汤琼脂培养基(平板培养基)：液体培养基中加入琼脂15.0 g/L。

1.1.3 试剂与仪器 细菌细胞裂解液：B-PERTMBacterial Cell Lysis Reagents(Thermo Fisher Scientific)。雷磁pH计(PRS-3G，上海仪电科学仪器有限公司)；Bio Photometer 核酸蛋白检测仪(德国，艾本德)；恒温振荡培养箱(ZQZY-78AV，上海知楚仪器有限公司)；高压灭菌锅(GI54DWS，致微仪器有限公司)；全自动酶免分析仪(Synergy LX,BioTek Instruments Inc.)。

1.2 方法

1.2.1 菌悬液的制备 在超净工作台内，挑取一环平板培养基上的单菌落接种于100 mL 液体培养基中。30 ℃、150 r/min恒温培养12 h后，取2 mL菌液于100 mL 液体培养基中，30 ℃、150 r/min恒温培养6 h，用液体培养基调整菌液OD600为0.5(Cell/mL=2.25×108)，作为备用菌悬液。

1.2.2 菌液OD600检测 在超净工作台内，取2 mL菌液，用液体培养基稀释3倍后在蛋白核酸测定仪上测定其OD600值，平行测定3次，结果取平均值。

1.2.3 CA活性检测 CA 活性检测参照刘璐等[13]的方法，略作改进。采用酶标仪在400 nm处检测对硝基苯酚(p-NP)浓度，并作其随时间变化曲线，计算CA活性。①绘制对硝基苯酚标准曲线；②工作液的制备：0.02 mmol/L 乙酸对硝基苯酯(p-NPA)溶于1 mL无水乙醇，0.02 mmol/L二乙基丙二酸溶于9 mL磷酸缓冲溶液，将两者混合均匀；③粗酶液制备：取5 mL菌悬液10 000 r/min离心5 min，取上清液稀释2倍后，与工作液1∶1混合，制成胞外CA酶液；取5 mL菌悬液与1 mL B-PERTMBacterial Cell Lysis Reagents混合均匀，静置30 min，10 000 r/min离心5 min，取上清液稀释2倍后，与工作液1∶1混合，制成总CA酶液；④酶活性检测：将粗酶液放入酶标检测盒中，25 ℃反应3 min后测定OD400；⑤利用标准曲线求出生成p-NP的浓度，计算CA活性。酶活性定义：每毫升每分钟内生成1 μmol p-NP所需的酶量，单位：U/mL。

1.2.4 培养基初始pH对B.safensis生长及其产CA的影响 用5 mol/L NaOH溶液与1 mol/L HCl溶液调节液体培养基初始pH值分别至6.0、7.0、8.0、9.0。以2%(体积分数，下同)的接种量将菌悬液(OD600=0.5)接至100 mL液体培养基中，置于30 ℃、150 r/min的恒温摇床中培养。分别于4、8、12、24、36、60、84 h检测菌液OD600，12、24、36、60、84 h检测CA活性。每组实验设3个平行样，结果取平均值。

1.2.5 接种量对B.safensis生长及其产CA的影响 以1%、2%、4%、8%的接种量分别将菌悬液接至100 mL 液体培养基(pH=7.0)中，置于30 ℃、150 r/min的恒温摇床中培养。分别于4、8、12、24、36、60、84 h检测菌液OD600，12、24、36、60、84 h检测CA活性。每组实验设3个平行样，结果取平均值。

1.2.6 温度对B.safensis生长及其产CA的影响 以2%的接种量将菌悬液接至100 mL 液体培养基(pH=7.0)中，分别置于20、25、30、35、40、45、50和60 ℃、150 r/min的恒温摇床中培养。分别于4、8、12、24、36、60、84 h检测菌液OD600，12、24、36、60、84 h检测CA活性。每组实验设3个平行样，结果取平均值。

1.2.7 转速对B.safensis生长及其产CA的影响 以2%的接种量将菌悬液接至100 mL 液体培养基(pH=7.0)中，分别置于120、150、180 r/min、45 ℃的恒温摇床中培养。分别于4、8、12、24、36、60、84 h检测菌液OD600，12、24、36、60、84 h检测CA活性。每组实验设3个平行样，结果取平均值。

1.2.8 金属离子对B.safensis生长及其产CA的影响 设定Zn2+、Co2+、Cd2+、Mn2+、Mg2+、Ca2+等金属离子浓度梯度为0.005、0.010、0.020 mmol/L。以2%的接种量将菌悬液接入含不同浓度金属离子的100 mL 液体培养基(pH=7.0)中，置于150 r/min、45 ℃的恒温摇床中培养60 h后检测CA活性。每组实验设3个平行样，结果取平均值。

1.2.9 最佳培养条件下B.safensis生长及其产CA特性 以2%的接种量将菌悬液接至100 mL含0.010 mmol/L Mn2+的液体培养基(pH=7.0)中，置于150 r/min、45 ℃的恒温摇床中培养。定期取样检测菌液OD600和CA活性。每组实验设3个平行样，结果取平均值。

2 结果与分析

2.1 对硝基苯酚标准曲线的绘制

配制不同浓度p-NP溶液(0、0.02、0.04、0.06、0.08、0.10 mmol/L)，在波长400 nm下测定其吸光度，结果见图1。

图1 对硝基苯酚标准曲线图

2.2 培养基初始pH对B.safensis 生长及其产CA的影响

不同初始pH条件下，B.safensis生长及其产CA活性变化如图2所示。初始pH在6.0～9.0范围内，其对细菌生长几乎无影响，说明该菌株对弱酸和弱碱性环境均有一定的耐受性。初始 pH值为7.0时，菌液OD600值最高，为3.97。初始pH对CA活性的影响较为明显。在不同初始pH条件下，CA活性均随着培养时间延长呈先增长后降低的趋势，并在60 h左右达到峰值，其中初始 pH值为7.0时酶活最高，为0.182 U/mL。Zheng等[7]报道，初始pH值为8.0时，胶冻样芽胞杆菌产CA的活性最高，但在7.0～9.0范围内，酶活变化不大。本研究表明，B.safensis产CA最适的初始pH值为7.0，这可能与细菌种类、培养基组份不同而导致培养后期pH值存在差异有关。

2.3 接种量对B.safensis生长及其产CA的影响

接种量对B.safensis生长及其产CA活性的影响如图3所示。接种量对细菌生长的影响无显著差异，均在36 h达到峰值，其中接种量为2%时，菌液OD600值最高，为4.36。接种量为2%时，在12～60 h培养期内，CA的活性逐渐升高，60 h达到峰值。结果表明，在接种量为2%条件下更有利于B.safensis生长和获得高活性的CA。

2.4 培养温度对B.safensis生长及产CA的影响

如图4所示，随着温度升高，B.safensis生长加快，到达30 ℃最适温度后，其生长开始减慢，而在60 ℃时几乎不生长，这可能是高温对细胞内蛋白质和核酸等发生了不可逆的伤害[14]。在35～45 ℃条件下，细菌在对数生长期的OD600值最低，为2.31。

图2 培养基初始pH对B.safensis生长与CA活性的影响Fig.2 Effects of initial pH of the medium on B.safensis growth and CA activitya：生长曲线；b：酶活曲线a: Growth curve; b: Enzyme activity curve

图3 接种量对B.safensis生长与CA活性的影响Fig.3 Effects of inoculum size on B.safensis growth and CA activity a：生长曲线；b：酶活曲线a: Growth curve；b: Enzyme activity curve

图4 培养温度对B.safensis生长与CA活性的影响Fig.4 Effects of incubation temperature on B.safensis growth and CA activity a：生长曲线；b：酶活曲线a: Growth curve；b: Enzyme activity curve

与30 ℃相比，在35、40和45 ℃条件下，细菌数量分别在培养60、36、36 h后急剧下降，但其产CA的活性反而明显提高，其中温度为45 ℃时的酶活最高，60 h时的酶活约是30 ℃时的4.76倍。

为了验证B.safensis胞内是否产CA及温度对CA活性的影响，在接种量为2%、培养基初始pH值为7.0、摇床转速为150 r/min的条件下，设置培养温度为30、45 ℃，培养时间为84 h，定期检测其胞外及总CA的活性，结果见图5。结果表明，总CA的活性均高于胞内CA，表明B.safensis产胞内CA。温度为45 ℃、培养时间为60 h时，总CA的活性和胞内CA活性均达到最高。而且培养温度为45 ℃的总CA活性比30 ℃高5.7倍。

图5 培养温度对B.safensis胞外和总CA活性的影响Fig.5 Effects of incubation temperature on extracellular and total CA activity of B.safensis

2.5 转速对B.safensis生长及其产CA的影响

在不同摇床转速条件下，B.safensis生长及其产CA的活性变化如图6所示。细菌的生长随着摇床转速的增加而加快。当转速为120 r/min时，细菌生长速度较慢，分泌积累的CA活性较低；当转速为180 r/min时，会产生较大的剪切作用，对酶的活性产生抑制；当转速为150 r/min时，CA活性最高，并在60 h达到最大值。

2.6 金属离子对B.safensis产CA的影响

金属离子对B.safensis产CA活性的影响如图7所示。结果表明，Zn2+、Mn2+、Ca2+、Mg2+均能提高CA活性的表达。其中，0.010 mmol/L Mn2+的作用最大，比对照组提高了2.6倍；0.010 mmol/L Zn2+和0.005 mmol/L Mg2+次之，分别比对照组提高了1.59倍和1.69倍；0.005 mmol/L Ca2+也使CA的活性略有增加。而Cd2+对CA活性几乎没有影响，Co2+会抑制CA活性。

2.7 最佳培养条件下B.safensis生长及其产CA特性

在最佳培养条件下，B.safensis生长及其产CA特性如图8所示。细菌几乎无生长迟滞期，快速进入对数期，24 h达到生长最大值，说明该菌株对环境具有很好的适应能力。24 h后细菌生长速度趋于平缓，进入生长稳定期，36 h后生长速度开始急剧下降，进入凋亡期。在12～60 h，CA活性逐渐升高，60 h达到峰值2.46 U/mL。60 h后CA活性逐渐降低，这可能是由于培养基营养物质的消耗，毒性产物(OH-)的积累，其他蛋白酶的产生或抑制CA活性的胞外代谢物等原因造成的[2,6]。

图6 转速对B.safensis生长与CA活性的影响Fig.6 Effects of rotational speed on B.safensis growth and CA activity a：生长曲线；b：酶活曲线a: Growth curve; b: Enzyme activity curve

图7 金属离子对B.safensis CA活性的影响Fig.7 Effect of metal ions on B.safensis CA activity

图8 最佳培养条件下B.safensis生长曲线与CA活性曲线Fig.8 Curve of B.safensis growth and CA activity under the optimum culture condition a：生长曲线；b：酶活曲线a: Growth curve; b: Enzyme activity curve

3 讨 论

掌握细菌的生长和产CA特性，对获得高活性酶液具有重要的意义。为了探明培养条件对B.safensis生长及其产CA的影响，通过单因素实验，确定了其产高酶活性CA的最佳培养条件。研究发现B.safensis产高酶活性CA的最佳培养条件与其最佳生长条件并不完全一致。该菌株在30 ℃条件下生长最快，而45 ℃时产CA的酶活性最高；在培养24 h 时细菌生物量最大，但进入衰亡期(60 h)CA酶活性最大。微生物在适宜的生长环境下，生长迅速、代谢旺盛。Zheng等[7]和Kaur等[8]的研究表明B.mucilaginosus与B.megaterium的生长和产高酶活性CA的培养条件均一致，且生物量最大时酶活性最高。本研究中，通过总CA活性检测，证实B.safensis具有产胞内CA的能力。当温度升高或细菌进入衰亡期，菌体自溶导致了胞内CA外排，使总CA活性增高。因此，充分利用细菌胞内CA，获得高酶活性的酶液具有重要的实际意义。李为[15]通过研磨破裂细菌细胞获得胞内CA。本研究采用细菌细胞裂解液裂解细菌，使细菌胞内CA释放，便于对胞内CA的进一步利用。

CA促进CO2水合反应的核心机理是金属离子对CO2的亲核攻击[16]。因此，金属离子对CA活性影响显著。目前通常使用Zn2+作为辅助因子，激活CA活性。然而，在已发现的9种不同基因水平上的CA(α-、β-、γ-、δ-、ε-、ζ-、η-、θ-、ι-CA)[17]中，虽然其结构相似度不高，但每种CA的活性中心都会结合一个对催化过程起着重要作用的金属离子。α-，β-，η-，θ-CA均以Zn2+作为辅助因子[18-23]；γ-CA 以Zn2+、Fe2+、Co2+作为辅助因子[20]；δ-CA 以Zn2+、Co2+作为辅助因子[24-25]；ζ-CA以 Zn2+、Cd2+作为辅助因子[26]；ι-CA以Mn2+作为辅助因子[17,27]；而ε-CA的辅助因子至今未见报道[28]。为了探明B.safensis产CA的辅助因子，研究了Zn2+、Co2+、Cd2+、Mn2+、Mg2+、Ca2+等金属离子对酶活性的影响。结果表明Mn2+对B.safensisCA活性的激活作用最显著。最近，Jensen等[17]从Thalassiosirapseudonana中鉴定了一种以Mn2+作为CA辅助因子的新型ι-CA。推测获得的B.safensis菌株也可能产ι-CA。