刘 顺，翁歆之，郑晓叶，黄 培，贺 洁，郑青松*

(1.浙江省玉环市水产技术推广站，浙江玉环 317600；2.浙江省台州市水产技术推广总站，浙江台州 318000； 3.浙江省水产技术推广总站，浙江杭州 310023)

台州地区是浙江省凡纳滨对虾的重要养殖区，近年来，对虾养殖过程中各类病害频发严重制约当地对虾养殖业的发展。对虾养殖生产中的病原有对虾白斑病毒(White spot syndrome virus,WSSV)、传染性皮下和造血器官坏死病病毒(Infectious hypodermal and hematopoietic necrosis virus,IHHNV)、高致病性副溶血弧菌(Vibrioparahemolyticus,VP)和虾肝肠胞虫(Enterocytozoonhepatopenaei,EHP)。对虾白斑病毒和高致病性副溶血弧菌往往发病迅速并造成大量死亡，传染性皮下和造血器官坏死病毒和虾肝肠胞虫则会引起对虾生长缓慢、规格参差不齐，这4种病原引起的疫病暴发会造成对虾养殖业经济损失巨大。为了解凡纳滨对虾4种病原在台州地区的感染情况，对2017年-2019年该地区收集的337个凡纳滨对虾样品进行4种病原的感染情况检测，总结4种病原在该地区的感染和流行情况，以期为此类疫病的防控提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 样品来源 2017年-2019年每年5月～9月从浙江台州地区海水养殖区和淡水养殖区采集凡纳滨对虾虾苗及中成虾，虾苗规格0.8 cm～1.5 cm，采集样品量不少于200尾；中成虾规格5.0 cm～12.0 cm，取鳃、肝胰腺、肠道和尾部肌肉混合，样品保存于950 mL/L乙醇中备用。不同养殖方式、不同规格对虾分年份采集样品组成见表1。

1.1.2 主要试剂与仪器 海洋动物组织基因组DNA提取试剂盒，天根生化科技(北京)有限公司产品；Taq酶和DL 2 000 Marker，宝生物工程(大连)有限公司产品；引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。PCR仪、凝胶成像分析系统，美国Bio-Rad公司产品。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取 将保存于950 mL/L乙醇中的样品取出，先用双蒸水润洗1次，再用无菌滤纸吸去多余水分，取适量样品用于基因组DNA提取，按照海洋动物组织基因组DNA提取试剂盒说明书提取基因组DNA，DNA样品保存于-20℃备用。

1.2.2 PCR检测 WSSV、IHHNV检测引物参照文献[1]中规定的检测引物，EHP检测引物参考文献[2]，AP检测引物参考文献[3](表2)。PCR反应体系50 μL：10×PCR buffer(Mg2+plus) 5 μL，dNTP Mixture(2.5 mmol/L) 4 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各2 μL，TakaraTaq酶(5 U/μL) 0.25 μL，模板DNA 2 μL，灭菌水34.75 μL，各组分充分混匀后进行扩增反应。反应结束后，取5 μL PCR产物琼脂糖凝胶电泳检测，凝胶成像分析系统观察并拍照，对比阳性对照电泳条带位置，扩增片段与阳性对照片段位置一致则判定为阳性，并将阳性样品PCR产物送到生工生物工程(上海)股份有限公司测序验证。

表1 对虾样品组成

表2 引物序列信息

1.2.3 数据分析 排除病原混合携带情况，数据统计不考虑病原混合携带情况而单独计数。用统计软件SPSS19.0进行统计学分析。用χ2检验，以P<0.05表示差异显著，P<0.01表示差异极显著。相关性分析用Pearson相关系数，以P<0.05表示相关性显著，P<0.01表示相关性极显著。气象数据来自台州市气象局。

2 结果

2.1 养殖对虾各病原携带情况

2017年-2019年4种病原总体携带率EHP>IHHNV>AP>WSSV(表3)。不同年份养殖对虾WSSV、IHHNV、AP、EHP 4种病原的携带率分别为2017年1.98%、36.64%、7.92%、51.49%；2018年4.03%、23.39%、4.84%、45.97%；2019年0、29.46%、10.71%、27.68%。检测的4种病原2017年和2018年携带率均为EHP>IHHNV>AP>WSSV，2019年为IHHNV>EHP>AP>WSSV。2017年-2019年台州地区养殖凡纳滨对虾不同年份EHP的携带情况差异极显著(P<0.01)，且不同年份EHP携带率呈逐年下降趋势；不同年份WSSV、IHHNV和AP的携带情况均无显著差异(P>0.05)，同时3种病原不同年份的携带情况变化趋势亦均不明显(图1)。

图1 2017年-2019年各病原携带趋势变化

2.2 不同规格养殖对虾病原携带情况

2017年-2019年IHHNV、AP和EHP在虾苗和中成虾中总体携带率较为一致，均为虾苗>中成虾，WSSV携带率则为中成虾>虾苗。不同年份EHP在虾苗和中成虾中携带率均为虾苗>中成虾，IHHNV和AP则在2017年和2018年为虾苗>中成虾，2019年为虾苗<中成虾。不同年份IHHNV在虾苗和中成虾中携带情况差异显著(P<0.05)；不同年份EHP在虾苗和中成虾中携带情况差异极显著(P<0.01)；而不同年份WSSV和AP分别在虾苗和中成虾中携带情况则均无显著差异(P>0.05)(表4)。

表3 2017年-2019年4种病原检测总体情况

表4 4种病原在虾苗与中成虾中检测结果

2.3 不同养殖水体对虾病原携带情况

2017年-2019年不同年份IHHNV和AP携带率均呈现出海水>淡水，但不同年份IHHNV在海水与淡水养殖对虾的携带情况差异显著(P<0.05)，AP的携带情况无显著差异(P>0.05)；EHP携带率2017年海水养殖对虾略高于淡水养殖对虾，2018年和2019年则均为淡水养殖对虾>海水养殖对虾，但各年份海、淡水养殖对虾无显著差异(P>0.05)；WSSV总体携带率为淡水养殖对虾>海水养殖对虾，其中2017、2018年携带率均为淡水养殖对虾>海水养殖对虾，2019年则未检出阳性样品，各年份海、淡水养殖对虾无显著差异(P>0.05)(表5)。

2.4 不同病原混合携带情况

对2017年-2019年全部337份样品检测结果统计分析，检测到4种病原混合携带样品共41例，其中二重病原携带检出4个类型共38例，IHHNV+EHP携带率最高，阳性样品数/携带率分别为29/8.61%；其次为AP+EHP，对应的阳性样品数/携带率分别为5/1.48%，WSSV+IHHNV和IHHNV+AP的携带率较低，对应的阳性样品数/携带率分别为2/0.59%、2/0.59%。三重病原携带检出2个类型共3例，分别为WSSV+IHHNV+EHP、IHHNV+EHP+AP，对应的阳性样品数/携带率分别为1/0.30%、2/0.59%，未检测到其他混合携带情况。

2.5 各病原携带与环境因子的关系

通过对2017年-2019年5月～9月的月平均降水量、月平均气温与各病原携带率的相关性分析发现，各病原携带率与月平均降水量无明显相关性，月平均气温则与IHHNV和AP均呈显著正相关(表6)，说明气温显著影响IHHNV和AP的发生。

表5 海水、淡水不同养殖水体检测结果

表6 环境因子与各病原携带率相关性

3 讨论

2017年-2019台州地区养殖对虾WSSV、IHHNV、AP、EHP 4种病原中EHP的总体携带率最高，达到41.54%，其虾苗携带率高达55.56%。IHHNV为第2高携带率的病原，与全省虾苗IHHNV携带情况相比[4]，台州地区虾苗IHHNV携带率明显高于全省整体水平，说明当地EHP和IHHNV的流行较为严重，应进一步加强2种病原的动态监测和防控工作。AP是2010年新确认病原[5]，2013年-2016年浙江省养殖对虾副溶血弧菌源AP毒力因子的携带率为10.34%[6]，远低于调查的8个省市的平均水平33.11%，说明该病原在浙江省内的流行范围有限。

4种病原中EHP、IHHNV和AP在虾苗中的携带率高于中成虾。成虾比小规格虾的EHP感染率更高[7]，本研究发现虾苗EHP携带率更高。台州地区对虾苗种来源于福建、广东、海南等地区，虾苗在放养之前已携带病原的风险较高，此外，刚放养的虾苗受水质环境改变影响也更容易感染病原。WSSV在虾苗和中成虾中的携带率都较低。本次调查台州地区养殖虾苗和中成虾的WSSV携带率均低于全省水平，说明近几年WSSV携带率整体呈下降趋势。

对虾WSSV、IHHNV、EHP等病原分别与自然海区和养殖环境中的甲壳类[8]、贝类[9]、丰年虫[10]以及藻类[11]之间等存在交叉感染，AP因在水体环境、沉积物中含量丰富，当环境改变或被摄食也更容易成为条件致病菌感染养殖对虾。相比较其他几种病原，本研究发现IHHNV在海水养殖对虾中携带率高于淡水养殖对虾，说明盐度对IHHNV感染对虾具有一定影响，与文献[12]结果相反。台州温岭、玉环、三门等地作为虾贝混养的重要地区，不同生物间病原存在交叉感染、垂直传播风险，以及养殖过程中环境改变、饵料质量、日常管理等问题也是对虾IHHNV高携带率的重要原因。

本研究中的4种病原均有混合携带情况，包括4种二重病原携带类型和2种三重病原携带类型，在所有混合病原携带情况中IHHNV+EHP的混合携带率最高，三重病原携带类型相对较少。各病原混合携带样品数在所有该病原阳性样品中比例分别为WSSV 42.86%、IHHNV 36.36%、AP 34.62%、EHP 26.43%，可知WSSV阳性样品中混合携带比例较高，而IHHNV则在6种混合携带类型中占5种，说明IHHNV混合携带情况更为普遍。目前研究报道对虾病原混合携带的类型有WSSV+IHHNV[13]、IHHNV+EHP[14]、EHP+AP[15]。也检测到目前尚未报道的类型，反映出台州地区病原混合携带类型较复杂。

IHHNV的流行与温度有中度相关性[16]，AP在低温季节养殖对虾患病机率低于高温季节[17]，与本研究结论相一致。

台州地区养殖凡纳滨对虾4种病原的携带存在不同程度的流行情况，各病原的携带主要与虾苗水平传播、养殖环境因子改变诱发等有关。在实际养殖生产过程中各病害的发生应以预防为主，虾苗应选用SPF苗种、合理控制放养密度、适时调节水质、科学合理投饵等手段预防疫病发生。对于WSSV、IHHNV等病毒性疾病目前尚无特效药，应从加强亲本、苗种、幼虾、成虾全链条的检疫检测入手进行有效防控，AP、EHP等疫病的防控应注重养殖前期环境的管理，同时可合理使用渔用标准药物防治。